Modulation of ion transport in inflammatory bowel diseasesregulatory targets

Resumen

1. INTRODUCTION El transporte de electrolitos, nutrientes y agua que ocurre en la membrana intestinal es consecuencia de los procesos absortivos y secretores de la misma. El agua se mueve siempre por mecanismos pasivos de un lado a otro del epitelio, mientras que los electrolitos responden a procesos activos de las proteínas transportadoras. Así, el movimiento de agua viene regulado indirectamente por la propia regulación del transporte electrolítico. Los procesos de tipo secretor están asociados fundamentalmente al cloro, mientras que los de tipo absortivo se asocian al sodio. Ambos se encuentran perfectamente regulados en condiciones fisiológicas. Existen una serie de factores endógenos y exógenos que contribuyen a ese control. La regulación endógena se lleva a cabo por una serie de procesos paracrinos, endocrinos, inmunológicos y neurocrinos. Las toxinas bacterianas constituyen los factores exógenos más importantes que contribuyen a la regulación. Ambos, convergen en la señalización de segundos mensajeros a nivel del enterocito, como es el caso del AMPc o del calcio. Por otro lado, la inflamación intestinal está asociada a cambios profundos de tipo fisiopatológico, entre los cuales se encuentran las alteraciones en el transporte iónico epitelial y en la función de barrera del epitelio. Ambos factores contribuyen decisivamente al desencadenamiento de la diarrea, y la alteración de la barrera epitelial puede además contribuir a la propia reacción inflamatoria [1-3]. Los trastornos del transporte hidroelectrolítico constituyen en general la raíz de la mayor parte de los procesos de tipo diarreico (de cualquier etiología), de forma que las alteraciones de la motilidad desempeñan típicamente un papel secundario o accesorio. En general, la diarrea puede asociarse tanto a procesos agudos con mayor o menor componente inflamatorio (intoxicaciones alimentarias, diarreas infecciosas, colitis pseudomembranosa, etc.) y de etiología conocida, como a la inflamación crónica, particularmente la Enfermedad Inflamatoria intestinal (EII), que comprende la colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn [4]. Dicha EII se caracteriza, pues, por una inflamación crónica y recurrente del tracto digestivo, de etiología y patogénesis aun desconocidas, pese a los grandes avances que se han realizado en la identificación de los mecanismos fisiopatológicos. Se alternan periodos de exacerbación de los síntomas, seguidos de intervalos más o menos prolongados de remisión de los mismos [4, 5]. Hoy en día dichos síntomas carecen de un tratamiento efectivo que cure la enfermedad de forma definitiva, por lo que éste está destinado únicamente a mejorar la sintomatología. Pese a que no se conocen los mecanismos responsables de la iniciación y mantenimiento en el tiempo del proceso inflamatorio intestinal, se considera que en su fisiopatología están implicados componentes de tipo genético, ambiental e inmunológico. Desde el punto de vista mecanístico la diarrea puede estar producida por un incremento en la secreción, por una disminución de la absorción, por una fuga de líquido propiciada por defectos en la barrera epitelial, o por una combinación de estos factores. Sin embargo, el escenario con el que nos encontramos en la EII, con diarrea de tipo crónico, es completamente diferente. Así, podemos profundizar alteraciones a nivel de secreción y a nivel de absorción intestinal. - Alteraciones en la secreción Numerosos mediadores proinflamatorios se comportan como agentes secretagogos in vitro, como las prostaglandinas [6], los leucotrienos [7, 8], el factor activador de plaquetas [9], la histamina [10], la serotonina [11], la IL-1¿ [12, 13], el TNF [14, 15], las especies reactivas de oxígeno y nitrógeno [16], e incluso homogenados de tejido humano afectado por EII [17]. Sin embargo, tanto el transporte iónico basal como la respuesta secretora del tejido inflamado están invariablemente inhibidos, tanto en humanos como en modelos animales de características diversas [17-23]. Por tanto, la secreción iónica no es responsable de la diarrea y en cambio se inhibe en la inflamación crónica, lo que puede interpretarse como una adaptación protectora ante la cronificación del proceso diarreico. La comprensión de este mecanismo tiene un evidente interés, tanto en lo que respecta a la EII como a las posibles implicaciones fisiopatológicas y farmacológicas en la diarrea en general. Además, la inhibición del transporte se prolonga más allá de la resolución de la inflamación [17-24] y afecta también a zonas distales al foco inflamatorio [25]. Investigaciones llevadas a cabo por nuestro grupo de investigación han puesto de manifiesto que el defecto en la secreción iónica está relacionado con una producción reducida de AMPc en el epitelio, lo que reduce la activación del canal CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator) y en consecuencia la secreción basal y estimulada [26]. Aunque se desconoce la causa de la disminución de los niveles de AMPc, existe una clara implicación de la submucosa, dado que la disección de esta capa anula, al menos parcialmente, la inhibición de la secreción [26, 27]. Otros autores han puesto de manifiesto que el óxido nítrico (NO) puede estar implicado, debido a que la inhibición cede parcialmente con el uso de bloqueantes de la iNOS como el L-NIL (L-N6-(1-iminoetil)lisina) [18, 28]. El NO ejerce acciones antisecretoras indirectas (operando sobre leucocitos) y directas (inhibiendo la adenilato ciclasa (AC- epitelial) [29, 30]. Sin embargo, la influencia del NO en este contexto es en la actualidad controvertida, dado que la secreción inducida por estimulación colinérgica no se ve afectada y la inhibición de iNOS no se asocia siempre a la resolución de la respuesta inhibida. Además el NO ha sido implicado en la diarrea inflamatoria por otros autores [31, 32], y es un agente secretagogo in vitro [33] que ha sido propuesto como agente mediador de la respuesta a laxantes [34, 35]. Por tanto, existen diversos factores propuestos como reguladores del sistema de secreción epitelial cuya contribución efectiva ha de ser clarificada. Las citoquinas proinflamatorias (IFN, TNF) tienen un efecto prosecretor agudo pero reducen la expresión de transportadores como la ATPasa Na+/K+, el NKCC1 y tal vez el CFTR, aunque los resultados son contradictorios [21, 36, 37]. En general, no se han descrito otros mecanismos de actuación para las citoquinas, ni está claro hasta qué punto el efecto sobre la expresión de transportadores afecta a la secreción, particularmente si tenemos en cuenta que la inhibición es rápidamente reversible in vitro [26]. - Alteraciones en la absorción La absorción de Na+ (y agua) está incuestionablemente inhibida en el intestino inflamado, tanto en humanos como en modelos animales [22, 38, 39] . Desde el punto de vista mecanístico este fenómeno está poco caracterizado, aunque se ha relacionado con alteraciones en la actividad y/o expresión de transportadores, fundamentalmente la ATPasa Na+/K+, el canal ENaC y el transportador NHE3 y DRA [40] [41]. Las citoquinas TNF e IFN y el NO pueden estar implicados en estas acciones [38, 42]. A pesar de la importancia clínica de este fenómeno, se desconoce la reversibilidad o no de esta disfunción. También en este caso las citoquinas proinflamatorias parecen jugar un papel importante a nivel de expresión de transportadores, aunque existen datos contradictorios al respecto. Todos estos hallazgos de tipo regulador a nivel de absorción y secreción, añadidos a las alteraciones a nivel de expresión de los distintos transportadores iónicos, son la clave para explicar el estado hiposecretor del transporte hidroelectrolítico del enterocito en la EII. Es de destacar que en estudios previos a la parte experimental de esta tesis doctoral se ha llevado a cabo un examen exhaustivo de la situación actual del transporte iónico transepitelial en el intestino inflamado, dando lugar a la publicación de dos revisiones publicadas en revistas de alcance internacional [43, 44]. 2. OBJETIVOS Los objetivos iniciales de esta tesis doctoral se centraron en el estudio del efecto de distintos alimentos funcionales en las alteraciones del transporte hidroelectrolítico intestinal en la inflamación colónica, así como una mejor caracterización de la fisiopatología de dichas alteraciones en la EII. Los alimentos funcionales a estudiar fueron el glicomacropéptido bovino y distintos oligosacáridos, como fructooligosacáridos, inulina, oligosacáridos de la leche de cabra y AHCC (Active Hexose Correlated Compound). Sin embargo, en contra de nuestras expectativas, estos agentes mostraron una pérdida sustancial de modulación del transporte iónico, pese a su bien establecida actividad antiinflamatoria intestinal en ensayos preclínicos en modelos de EII. Por ello, decidimos desplazar nuestro campo de investigación a una profunda caracterización de las alteraciones del transporte hidroelectrolítico de la EII como tal, ya que aun hoy día, numerosos interrogantes quedan en el aire, pese a los esfuerzos de diversos grupos de investigación a nivel internacional. Así, proponemos 5 objetivos principales en esta tesis doctoral: 1. Llevar a cabo una profunda caracterización de las bases moleculares que hay detrás del defecto a nivel de transporte hidroelectrolítico en el intestino inflamado. Especialmente se busca estudiar si alteraciones a nivel del transportoma pueden explicar este estado hiposecretor. 2. Estudiar el origen de la relación entre niveles bajos de AMPc y la inhibición del transporte iónico en la EII. 3. Identificar los factores relacionados con la regulación del AMPc epitelial a través de la estimulación de la proteína Gi. 4. Validar nuestros resultados en muestras humanas, así como mediante el uso de técnicas complementarias, en particular a nivel de genómica funcional. 5. Llevar a cabo un ensayo técnico por análisis de Western blot debido a la necesidad del uso de controles de carga aplicado, entre otras, a las proteínas transportadoras de membrana. 3. MATERIAL Y MÉTODOS Para llevar a cabo estos objetivos, se emplearon diversas técnicas de cultivo y aislamiento celular, estudios de transporte y permeabilidad por cámara de Ussing, RT-qPCR, microarray, Western blot, inmunohistoquímica y determinaciones celulares por ELISA, LDH, silenciamiento celular o determinación intracelular de AMPc, así como un estudio experimental en ratas con colitis inducida por TNBS. 4. RESULTADOS Nuestros resultados experimentales pueden ser divididos en tres grandes bloques: BLOQUE I Para llevar a cabo el estudio de las bases moleculares subyacentes a la inhibición del transporte iónico en la inflamación intestinal, realizamos un análisis genético por microarray comparando colonocitos de rata control con colonocitos procedentes de colitis inducida por TNBS. De las secuencias genéticas alteradas por la inflamación, aproximadamente la mitad están aumentadas, y la otra mitad disminuidas respecto al control. Después de un análisis detallado de estos cambios, las alteraciones en el transportoma no explican la situación actual de transporte del intestino inflamado. Sin embargo, las proteínas reguladoras parecen jugar un papel importante a este nivel. Así, puesto que la vía del AMPc en también objeto de nuestro estudio, observamos alteraciones a nivel de encimas responsables de la síntesis y degradación de este segundo mensajero, como son la AC y la fosfodiesterasa. Concretamente, tres isoformas de AC están inhibidas en inflamación en estos estudios genómicos y postgenómicos: AC5, 6 y 9. BLOQUE II Puesto a que tras estudiar la expresión de los distintos transportadores de membrana no observamos una correlación directa entre ésta y el estado del intestino inflamado, y puesto a que podría haber vinculación entre los niveles de AMPc y el dicho estado hiposecretor, decidimos centrar nuestros estudios en las diferentes vías que modulan el AMPc y en su estado en condiciones de inflamación. Además intentamos indagar en los mecanismos moleculares que pueden estar implicados en la inhibición de la AC. Así, estudiamos 4 vías celulares en las que el AMPc está implicado: A. CITOQUINAS PROINFLAMATORIAS: Es hoy día reconocido que las diferentes mediadores proinflamatorios, como las citoquinas IL-1ß, TNF o IFN se encuentran sobreexpresadas en la EII. Además, dichas citoquinas han sido implicadas en alteraciones a nivel de transportadores iónicos intestinales. Así, en éste bloque de experimentos estudiamos la relación entre las citoquinas proinflamatorias, los bajos niveles de AC y la reducción de AMPc en condiciones inflamatorias. Para ello, comenzamos con un modelo de cultivo celular in vitro con células humanas Caco-2. Tras la preincubación 24h con dichas citoquinas, encontramos inhibición de las tres isoformas de AC (5,6 y 9) en los grupos tratados frente al control, menor concentración de AMPc intracelular, así como un estado hiposecretor de las mismas medido por cámara de Ussing. Estos resultados son validados en organoides procedentes de yeyuno de ratón, en donde volvemos a encontrar inhibición de las distintas isoformas de AC en presencia de citoquinas proinflamatorias. Además, el silenciamiento celular mediante partículas lentivirales para AC5 en células T84, o la inhibición de AC en tejido colónico de ratas control, presentan un estado hiposecretor en estudios de transporte en cámara de Ussing. B. ÓXIDO NÍTRICO: Estudiamos el papel del óxido nítrico en la inhibición del AMPc en inflamación mediante estudios en cámara de Ussing. Ni secuestrador de óxido nítrico carboxy-PTIO, ni la inhibición de la iNOS con L-NIL, ni el donador de NO NONOato, consiguen vincular al óxido nítrico, al menos de forma única, con la inhibición de la secreción iónica en inflamación. C. OPIOIDES ENDÓGENOS: Debido al mecanismo de acción de los opioides endógenos a través de Gi, la proteína que inhibe AC, decidimos estudiar dichos opioides como tal, así como un agonista de receptores delta-opioides: UFP-512. En ningún caso se explica el estado hiposecretor en inflamación. D. PROSTAGLANDINAS: Por último, decidimos estudiar otros mediadores inflamatorios implicados en la EII: las prostaglandinas, debido de nuevo, a su mecanismo de acción a través de Gi o Gs, modulando así la AC y las concentraciones de AMPc. Como era de esperar, todas tienen efectos prosecretores a nivel basal excepto la prostaglandina D2 (PGD2), con una acción mediada fundamentalmente a nivel de submucosa. Por ser la principal prostaglandina antisecretora, la PGD2, nos centramos en su mecanismo de acción en inflamación. La PGD2 tiene dos receptores, DP1 y DP2. DP1 actúa a través de Gs en AC, aumentando así las concentraciones de AMPc intracelulares, mientras que DP2 actúa a través de Gi reduciendo los niveles de AMPc en el enterocito. El bloqueo de DP2 con ramatroban, revierte parcialmente el grado hiposecretor en colon distal de ratas colíticas en cámara de Ussing. Cuando intentamos reproducir el efecto de PGD2 en biopsias de colonoscopias de pacientes sanos, observamos un efecto contrario de PGD2: es prosecretora en condiciones basales. Sin embargo, se observa una tendencia a recuperar este estado hiposecretor en condiciones de inflamación, estudiando la secreción de biopsias procedentes de pacientes con EII. Esta diferente actuación de la PGD2 en muestras control entre rata y humano se debe a una diferente expresión de los receptores DP1 y DP2. En ambas especies, sin embargo observamos un incremento de una de las dos encimas responsables de la síntesis de PGD2, L-PTGD sintasa. Además, llevamos a cabo un estudio del efecto del ramatoban (inhibidor del receptor DP2), y HQL-79 (inhibidor de la sintasa H-PGDS de PGD2) en la colitis inducida por TNBS en ratas, y pese a la reducción de marcadores inflamatorios como MPO, S100A8, IL-1ß, INOS, MCP-1 o TNF,mas IL10 IL17 ninguno de los dos tratamientos consiguen revertir el estado hiposecretor de la inflamación. BLOQUE III. En este último apartado se pretende abordar una cuestión de tipo técnico: la propuesta es validar el empleo del Rojo Ponceau, técnica rápida, reversible y económica, como control de carga en la técnica de Western blot, sustituyendo así al empleo de actina. De dicho estudio se publica un trabajo que hoy día cuenta con un total de 96 citas [45]. 5. CONCLUSIONES 1. En el modelo de colitis experimental inducida por TNBS en rata, la expresión epitelial de AC 5, 6 y 9 está inhibida. Este efecto puede deberse a citoquinas proinflamatorias (IL-1ß, TNF y IFN) y contribuye al defecto en la secreción iónica. El novedoso sistema de cultivo de organoides constituye un valioso modelo de validación no tumoral para dichos resultados. 2. El aumento de la producción de PGD2 en la colitis por TNBS en rata activa receptores DP2, con el subsecuente incremento en la función de la proteína Gi, reducción intracelular de los niveles de AMPc e inhibición de la secreción iónica basal. Ni el óxido nítrico no los opiáceos endógenos parecen jugar un papel sustancial a este nivel. 3. Cambios en el transportoma del enterocito no explican el estado de inhibición iónica en la colitis de rata por TNBS. 4. El efecto de PGD2 en colon no inflamado de humano es sustancialmente diferente al colon de rata, debido a diferencias de expresión en la transducción receptorial. Sin embargo, PGD2 puede inhibir la secreción iónica en biopsias de pacientes con IBD de manera similar que lo observado en colitis de rata por TNBS. 5. El eje PG2/ DP2 juega un rol patogénico en la colitis de rata por TNBS. La inhibición de la síntesis de PGD2 o la ocupación del receptor DP2 no revierte el defecto en secreción iónica. REFERENCIAS 1. Akbarali, H.I., C. Pothoulakis, and I. Castagliuolo, Altered ion channel activity in murine colonic smooth muscle myocytes in an experimental colitis model. Biochem Biophys Res Commun, 2000. 275(2): p. 637-42. 2. Li, J., et al., Experimental colitis modulates the functional properties of NMDA receptors in dorsal root ganglia neurons. American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology, 2006. 291(2): p. G219-28. 3. 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