Papel de las proteinas reguladoras de la familia RSM en la señalización mediada por diguanilato cíclico y el modo de vida multicelular de pseudomonas putida kt2440

Resum

En el medio ambiente, las bacterias se encuentran predominantemente formando comunidades multicelulares adheridas a superficies, conocidas como biopelículas o biofilms (Wingender et al., 1999). En una biopelícula, las células bacterianas ancladas a superficies bióticas o abióticas se hallan embebidas en una matriz compleja producida por las propias bacterias, entre cuyos componentes se encuentran exopolisacáridos (EPSs), proteínas, lípidos y ADN extracelular (Hall-Stoodley et al., 2004). Esta matriz extracelular ayuda a proteger a las células frente a factores de estrés. La formación de biofilms es un proceso altamente regulado que responde a diferentes señales ambientales (Costerton et al., Flemming y Wingender, 2010; Römling y Balsalobre, 2012). La red de regulación que conecta estos estímulos con cambios en la expresión génica asociados al desarrollo del biofilm es compleja y no del todo conocida. En ella, el segundo mensajero intracelular diguanilato cíclico (c-di-GMP) juega un papel clave, modulando la transición entre el estilo de vida planctónico, mótil, al modo de vida sésil de un biofilm (Zhang y Dong, 2004). Esta tesis se ha centrado en el papel que juega la familia de reguladores globales post-transcripcionales Rsm en la regulación de la formación de biopelículas bacterianas y la señalización por c-di-GMP, usando como modelo Pseudomonas putida KT2440, una bacteria de interés agrícola por sus propiedades como PGPR. Trabajos previos del grupo habían determinado que el sistema de dos componentes GacS/GacA regula la expresión de adhesinas implicadas en la formación de biofilms por esta bacteria. Dado que en otros microorganismos este sistema de dos componentes forma parte de una cascada de regulación mediada por proteínas de la familia Rsm, los objetivos de esta Tesis han sido caracterizar dichas proteínas en P. putida KT2440, analizar su implicación en la formación de biofilms y la señalización por c-di-GMP, e iniciar un estudio de su papel como reguladores globales. En el capítulo 1, “Self-Regulation and Interplay of Rsm Family Proteins Modulate the Lifestyle of Pseudomonas putida”, se describe el papel de las tres proteínas de la familia de reguladores post-transcripcionales de tipo CsrA/RsmA presentes en P. putida KT2440 (RsmA, RsmE y RsmI) en el estilo de vida de la bacteria, a través de la construcción de mutantes simples, dobles y triple, así como la sobreexpresión de los genes por separado y bajo la influencia de un promotor constitutivo. Así, se observó que un mutante triple presenta menos movilidad tanto de tipo “swimming” como de tipo “swarming” además de dinámica alterada de formación de biopelícula, en la que se observa mayor biomasa adherida a la superficie pero una dispersión más temprana del biofilm. Por el contrario, la sobreexpresión tanto de RsmE como de RsmI provoca una disminución en la capacidad de adhesión. El análisis de la expresión de los diferentes EPSs y adhesinas en los fondos mutantes reveló que estos cambios podrían deberse a una alteración en la composición de la matriz extracelular así como en los tiempos de síntesis de ésta (Huertas-Rosales et al., 2016) En el capítulo 2, “The Pseudomonas putida CsrA/RsmA homologues negatively affect c-di-GMP pools and biofilm formation through the GGDEF/EAL response regulator CfcR”, se profundiza en el estudio de la regulación de la expresión de cfcR, que codifica el único regulador de respuesta con dominios GGDEF/EAL en KT2440. Esta proteína está regulada a nivel transcripcional por RpoS, ANR y FleQ y su funcionalidad como diguanilato ciclasa require del multisensor histidina kinasa CfcA. En este capítulo se describe un nivel adicional de regulación de cfcR que opera a nivel post-transcipcional a través de las proteínas RsmA, RsmE y RsmI. Se ha demostrado la unión directa de estas proteínas a un motivo específico (5´-CAUGGAUG-3´) que solapa con el codón de inicio de la traducción de cfcR. La mutación de las proteínas Rsm causa una desrepresión de cfcR. Demostramos, por otro lado, que los niveles de diguanilato cíclico intracelular en KT2440 en fase estacionaria se deben en su mayoría a la acción de CfcR y que su mutación provoca una bajada crítica en estos niveles. En un triple mutante en Rsm, se puede observar que los niveles de c-di-GMP no solamente son superiores sino que además se elevan significativamente durante la fase exponencial de crecimiento de la bacteria. Los resultados de este capítulo permiten establecer que la cascada de señalización Gac/Rsm/c-di-GMP opera en P. putida a través de CfcR. En el tercer capítulo, “Global analysis of the Rsm regulon in Pseudomonas putida KT2440”, se ha realizado un estudio de RIP-seq para dilucidar de forma global los genes que podrían estar regulados de forma directa por las proteínas Rsm en P. putida. Más de 400 genes, regiones intergénicas y posibles sRNA son diana de estas proteínas, algunas específicas para cada una de ellas y otras que son compartidas por dos (95) o las tres (38) proteínas Rsm. Hemos comprobado que tanto cfcR como elementos implicados en su regulación aparecen entre las dianas, como era esperable a partir de los resultados del capítulo 2. También aparecen otros genes relacionados con la formación de biofilms. Aunque el análisis de dianas realizado es preliminar, este ha permitido generar el listado de genes y nuevos sRNA cuyo estudio nos permitirá completar el mapa de la regulación asociada a proteínas Rsm en P. putida KT2440.