Desarrollo de nuevas técnicas metabolómicas para la búsqueda de biomarcadores en tejidos y muestras biológicas

Resumen

En la era post-genómica se han incrementado los esfuerzos para describir la relación entre genotipo y fenotipo en células y organismos. Incluso conociendo el estado de los genes de un sistema vivo así como sus mensajes y proteínas, no se conoce la conexión completa con el fenotipo del mismo. Por esta razón se comenzó a estudiar el metaboloma, que es el producto final a los cambios genéticos o medioambientales de los procesos regulatorios celulares y su composición puede relacionarse con la última de las cadenas de respuestas de un sistema biológico. A diferencia de los genes y las proteínas, que están sujetas a regulaciones epigenéticas y modificaciones post-translacionales respectivamente, los metabolitos actúan como si fuesen una firma directa de la actividad bioquímica y, por ello, es más fácil relacionarlos con las características fenotípicas. De esta manera, la metabolómica y, en concreto, la metabolómica por perfiles, resulta una poderosa herramienta que se está adaptando ampliamente al campo del diagnóstico clínico. En este contexto, la espectrometría de masas ha ocupado una posición central y un papel creciente en las metodologías desarrolladas para el estudio metabolómico debido a su precisión, alta sensibilidad de detección a concentraciones bajas y por su versatilidad, puesto que se puede medir una amplia gama de productos de distinta naturaleza química en una sola medida. Además, las tecnologías metabolómicas se encuentran en pleno desarrollo con el fín de cubrir las complejas necesidades del estudio de los perfiles metabolómicos, especialmente en muestras clínicas. El progreso en las áreas de la biociencia depende muy directamente de los avances tecnológicos. En los últimos años se ha incrementado el desarrollo de nuevas tecnologías en genómica, transcriptómica, proteómica y metabolómica. Concretamente, los estudios metabolómicos se han centrado en muestras de gran tamaño o volumen pertenecientes a una muestra homogeneizada de un conjunto de células o de un tejido. No obstante, uno de los principales objetivos de la biología es conocer las ¿estrategias¿ químicas de las células para superar los cambios medioambientales y, en este caso, la metabolómica de célula-única, como expresión bioquímica más directa del fenotipo, tiene un papel fundamental en este conocimiento, aunque por otra parte es también la más difícil de analizar debido a su compleja composición y a la variabilidad de la misma en tiempo mínimo. Aun así, las aplicaciones del estudio metabolómico en una célula-única tienen un gran potencial en la química médica tales como el estudio de las células cancerosas, el desarrollo de células madre o el desarrollo de resistencia a fármacos. En el trabajo de esta tesis se presenta el desarrollo de una nueva tecnología basada en espectrometría de masas de análisis directo de una célula-única, sin pretratamiento de la muestra con procesos de purificación o separación con cromatografía. De esta manera, se pretende medir en una sola medida el metaboloma completo de dicha célula succionada. El análisis directo de una célula-única viva (LSCMS-Live single-cell mass spectrometry) se aplicó, con éxito, por primera vez a las células de un tejido vivo de origen vegetal, sin la destrucción del tejido, y se procedió a la medida de los perfiles metabolómicos de células-únicas de diferentes tejidos del mismo organismo. Debido a la complejidad y el volumen de datos generados, se utilizaron herramientas bioinformáticas para el análisis estadístico de los resultados. La nueva metodología demostró tener éxito en la medición cualitativa, semicuantitativa, del metaboloma a nivel celular, en su caracterización estructural con el uso de MS/MS y MS3 y en la detección de nuevos metabolitos no identificados anteriormente en el tipo de células estudiadas. Posteriormente, se aplicó dicha metodología adaptándola a muestras biológicas de sujetos en un estudio clínico de estrés inducido. En este trabajo se presenta un estudio piloto en muestras de sangre de voluntarios sanos donde se analiza el perfil metabolómico (relacionado con el estrés) con una metodología sencilla, rápida y mínimamente invasiva para el paciente, lo que puede llegar a proporcionar una herramienta objetiva del diagnóstico de estrés. Teniendo en cuenta los objetivos iniciales de este trabajo y las publicaciones presentadas relacionadas con el mismo, se pueden extraer las siguientes conclusiones: - Se ha podido diseñar un método para el análisis, estudio y caracterización de un número muy amplio de metabolitos de diferente naturaleza química, a tiempo real, en una sola célula localizada por medios visuales y sin destrucción del tejido estudiado. El método es rápido, directo, sin pretratamiento de la muestra, sensible y robusto a niveles de concentración de nanomoles. Ha demostrado ser una herramienta también efectiva en la detección de metabolitos desconocidos. (Publicación I, II y III) - Es el primer protocolo analítico para célula única en el que es posible realizar confirmación estructural de los metabolitos con experimentos de MS/MS y experimentos de MS3, sin destrucción del tejido. (Publicación II y III) - Se consiguió adaptar este protocolo a muestras de sangre de volúmenes muy pequeños, utilizando sólo una gota de sangre, para realizar el estudio metabolómico de estrés inducido en voluntarios sanos. El protocolo es efectivo en la detección de metabolitos específicos en cualquiera de los dos estados en que se encuentre el sujeto, basal (no estresado) o bajo estrés inducido. Por lo tanto tendrá utilidad para diferenciar entre ambos estados y efectuar separación por grupos. La metodología se presenta como una herramienta objetiva y no invasiva para el diagnóstico, pronóstico o seguimiento del estrés en diferentes individuos. (Publicación IV) - En el perfil metabolómico general de los dos estados existen todavía metabolitos específicos sin identificar que, potencialmente, podrían convertirse en nuevos biomarcadores, por lo que el trabajo de identificación de metabolitos específicos en ambos estados se continuará. (Publicación IV) - El método aporta la posibilidad de encontrar biomarcadores mediante la interrelación de los datos metabolómicos, por un lado, y cualquier otro dato clínico, genético o resultado de los test psicológicos realizados a los sujetos de estudio por otro. El estudio se continuará y deberá realizarse con un mayor número de individuos. (Publicación IV) - El método descrito puede poseer aplicaciones en otras patologías dentro de las diferentes enfermedades psiquiátricas.De la misma manera podría presentar aplicaciones generales de interés clínico. Bibliografía 1 Kell DB. (2007) The virtual human: towards a global systems biology of multiscale, distributed biochemical network models. Iubmb Life; 59:689¿95. 2 Westerhoff HV, Palsson BO. (2004) The evolution of molecular biology into systems biology. Nature Biotechnol; 22:1249¿52. 3 Kell DB, OliverSG. (2004) Here is the evidence, now what is the hypothesis? 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