Aislamiento e identificación de factores inhibidores del cotransporte na+ - k+ - 2cl-

Resumen

El cotransporte Na+-K+-2Cl- es un sistema de transporte iónico a través de membrana presente en una gran diversidad de células y tejidos animales. Su presencia a nivel renal en la rama gruesa ascendente de Henle conduce a una mayor reabsorción de Na+, favoreciendo la eliminación del mismo en orina. Partiendo de la evidencia científica confirmada de que las orinas de ratas sometidas a sobrecarga salina presentan una mayor actividad inhibidora del cotransporte Na+-K+-2Cl-, el objetivo principal de esta Tesis Doctoral fue la purificación de sustancias activas presentes en dichas orinas. Se utilizaron distintas técnicas de separación química: extracción líquido-líquido, extracción sólido-líquido, cromatografía de columna en gel de sílice, cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), cromatografía de intercambio iónico y electroforesis. La primera sustancia con capacidad de inhibir el cotransporte Na+-K+-2Cl- purificada fue el equol, fitoestrógeno de origen dietético. El estudio comparativo de la potencia inhibidora de distintos isoflavonoides sintéticos ensayados reveló la importancia del grupo hidroxilo en la posición 4' de la molécula. Los isoflavanos fueron los compuestos más activos. Se resolvió el equol racémico. Ambos enantiómeros fueron igualmente potentes. El mecanismo de regulación no es, por tanto, enantioselectivo. También se purificaron la urea y el amonio como componentes urinarios con capacidad inhibidora del cotransporte. Se pusieron a punto técnicas de análisis cuantitativo de las sustancias inhibidoras purificadas. Ni los isoflavonoides ni la urea son factores saldependientes. La excreción de amonio aumenta con la ingesta de sal. A partir de orinas carentes de isoflavonoides, urea y amonio, se obtuvieron dos fracciones biológicamente activas de elevada potencia inhibidora del cotransporte Na+-K+-2Cl-, cuyo análisis espectroscópico mostró que las sust