Hidrogeles supramoleculares constituidos por pequeños péptidos como medio para la obtención de materiales compuestos

Abstract

Los resultados experimentales obtenidos durante el desarrollo de la presente tesis doctoral, así como la discusión de los mismos, se presentan en esta memoria divididos en 5 capítulos. En los cuatro primeros capítulos se exponen los resultados obtenidos en la consecución de objetivos diferentes, sin bien toda la investigación realizada está enmarcada en el estudio de hidrogeles supramoleculares basados en péptidos cortos y su aplicación como medio para la obtención de materiales híbridos y compuestos. Estos capítulos constan de: introducción, planteamiento y objetivos, materiales y métodos, resultados y discusión, y conclusiones. El último capítulo (Capítulo 5) es un compendio de resultados obtenidos en colaboración con otros grupos de investigación que no están englobados en el eje central de la tesis doctoral. El contenido de los diferentes capítulos se resume a continuación: En el Capítulo 1, titulado “Hidrogeles supramoleculares anisótropos mediados por nanopartículas de hierro con mejores propiedades mecánicas” se plantea la posibilidad de modificar las propiedades mecánicas de un hidrogel supramolecular mediante la inclusión de nanopartículas magnéticas. En este sentido se propone el diseño y síntesis de hidrogeles supramoleculares basados en Fmoc-difenilalanina (FmoFF) que alberguen nanopartículas de hierro (FeNPs) en su interior, formados en presencia y ausencia de un campo magnético externo y el posterior estudio de las propiedades micro y macroestructurales. En la Introducción del Capítulo 1 se presentan los conceptos de material híbrido y material compuesto, así como de gel, haciéndose especial hincapié en los hidrogeles supramoleculares. Se detallan los aspectos más relevantes de los hidrogeles supramoleculares basados en péptidos cortos respecto a sus características, versatilidad y su aplicación como medio para la obtención de materiales híbridos y compuestos, definiendo de esta forma el marco global de la tesis doctoral. En lo referente a los resultados obtenidos, en el Capítulo 1 se presenta la síntesis y caracterización estructural de nuevos hidrogeles supramoleculares basados en péptidos cortos (FmocFF) híbridos con FeNPs. Estos hidrogeles híbridos se han preparado a través de la autoasociación de FmocFF en una suspensión que contenía FeNPs en presencia y en ausencia de un campo magnético externo. Estos hidrogeles en presencia de un campo magnético originaban agregados en forma de columnas de FeNPs observables mediante microscopía óptica. Las FeNPs fueron englobadas por las fibras peptídicas originando un material anisótropo en presencia de un campo magnético externo. Estos hidrogeles eran más rígidos frente a la aplicación de fuerzas de cizalladura aplicadas perpendicularmente que en paralelo, presentando valores de G’ (módulo de almacenamiento) hasta 7 veces superiores a los correspondiente a hidrogeles sin partículas. Este es el primer ejemplo en el que las propiedades mecánicas de hidrogeles peptídicos se ven modificadas sustancialmente por la presencia de FeNPs. Un estudio a nivel microscópico de las fibras mostró que la estructura secundaria peptídica apenas se modificaba por la presencia de las nanopartículas, demostrando la versatilidad de las interacciones supramoleculares para adaptarse a nuevos entornos y generar nuevos materiales. Por último, la difusión de un soluto por el entramado fibrilar apenas varió por la incorporación de las partículas, siendo este un escaso ejemplo en el que se consigue aumentar significativamente la dureza de un gel sin disminuir el tamaño de poro de la red reticular. En el Capítulo 2 titulado “Cristales de lisozima crecidos en hidrogeles de FmocCF presentan una mayor estabilidad frente al daño causado por radiación de rayos X” se plantea el objetivo de mitigar el daño por radiación sufrido por los cristales de proteína durante los experimentos de difracción de rayos X en sincrotrón, mediante la inclusión de fibras de hidrogeles supramoleculares con aminoácidos reductores a través de su cristalización en ellos. En este capítulo se hace una Introducción a la cristalización de proteínas, destacando la obtención de cristales de proteína compuestos mediante la cristalización en hidrogeles y, en particular, en hidrogeles supramoleculares basados en péptidos remarcando las ventajas que ofrecen estos a la hora de conferir nuevas propiedades a los cristales compuestos. Se han preparado y caracterizado hidrogeles de Fmoc-cisteína-fenilalanina (FmocCF), Fmoc-metionina-fenilalanina (FmocMF) y Fmoc-tirosina (FmocY). En ellos se ha ensayado la cristalización de las proteínas lisozima, glucosa isomerasa y taumatina, consiguiéndose cristales de gran calidad en todos los casos. Tras estudiar el efecto de la radiación sobre los cristales de lisozima crecidos en los hidrogeles más concentrados de FmocCF, y en comparación con cristales crecidos en agarosa, se pudo comprobar que dichos cristales presentaban una mayor resistencia frente al daño por radiación difractados a temperatura ambiente. Este es el primer ejemplo en el que se emplea un hidrogel con este fin y pone de manifiesto la utilidad de obtener cristales compuestos para dotarlos de nuevas propiedades. Hay que indicar que la cisteína es capaz de llevar su efecto al estar en estado gel ya que los grupos cisteína están anclados en las fibras peptídicas evitando posibles reacciones cruzadas con la proteína. La cisteína empleada en solución no es capaz de proteger a los cristales frente al daño por radiación. En el Capítulo 3 titulado “Obtención de cristales de lisozima reforzados con nanotubos de carbono catalíticos y conductores de la electricidad” se plantea diseñar, sintetizar y caracterizar hidrogeles supramoleculares híbridos de FmocFF con nanotubos de carbono de pared simple (SWCNTs), ensayar la cristalización de lisozima en los hidrogeles obtenidos, y estudiar los efectos de la incorporación de los SWCNTs en las propiedades mecánicas, catalíticas y eléctricas de los cristales de lisozima híbridos. Se ha desarrollado una metodología con la que preparar hidrogeles híbridos de FmocFF con SWCNTs que ha servido para dispersar homogéneamente agregados de SWCNTs hidrófobos en un medio acuoso compatible con la cristalización de lisozima. Con la posterior cristalización de lisozima en dichos hidrogeles se consiguió la incorporación efectiva de los nanotubos en el interior de los cristales sin alterar la calidad de los cristales ni su morfología. El estudio de las propiedades de los cristales entrecruzados de lisozima (CLLCs) con SWCNTs reveló que estos nuevos materiales híbridos presentaban mayor resistencia mecánica, actividad catalítica mejorada a altas temperaturas y conductividad eléctrica. Se ha demostrado que la conductividad eléctrica a través de los cristales era isótropa y muy eficiente, presentando valores de conductividad superiores a 600 nS a muy bajas concentraciones de SWCNTs (inferior a 0.05% en peso). Los resultados obtenidos en este capítulo ponen de manifiesto las oportunidades que ofrecen los hidrogeles supramoleculares basados en péptidos como medio para la obtención de materiales híbridos actuando como estabilizadores de nanotubos de carbono hidrófobos en un medio acuoso que ha posibilitado, por primera vez, la incorporación de nanotubos de carbono en cristales de proteína. En el Capítulo 4 titulado “De la mineralización biomimética de magnetita en hidrogeles supramoleculares a nanopartículas híbridas magnetita-lisina” se plantea la posibilidad de utilizar hidrogeles supramoleculares basados en péptidos como medio para la obtención de nanopartículas de magnetita (MNPs) mediante un proceso de mineralización biomimética (en agua, a temperatura ambiente). Como primera aproximación a este proyecto se ha estudiado el efecto de aminoácidos en disolución sobre el proceso de mineralización. En este estudio se ha podido comprobar que la lisina es capaz de ejercer un control sobre el tamaño de las MNPs producidas en agua a temperatura ambiente. Las MNPs obtenidas por este protocolo mostraron un tamaño promedio de 30 nm, alta magnetización de saturación, temperatura de bloqueo de 290 K y carga superficial negativa a pH fisiológico gracias a su recubrimiento con lisina. Además, este protocolo es respetuoso con el medio ambiente, de bajo coste y potencialmente escalable a nivel industrial. Las MNPs híbridas así obtenidas reúnen las características necesarias para poder ser usadas en aplicaciones biomédicas. El Capítulo 5 se ha titulado “Participación en otros proyectos” se describen los siguientes resultados más relevantes obtenidos en colaboración con otros grupos de investigación. A continuación, se resume el contenido de los distintos apartados de este capítulo: A) Se ha ensayado por primera vez el efecto in vivo de cristales de insulina crecidos en Fmoc-dialanina (FmocAA) y en agarosa. Se ha demostrado que estos cristales compuestos son físicamente estables al seguir siendo bioactivos después de haberlos mantenido a 50 ºC durante 7 días. Además la insulina crecida en FmocAA presenta una velocidad de disolución más lenta traduciéndose en un perfil de liberación retardada una vez administrada in vivo. B) Se ha llevado a cabo un estudio sistemático de las propiedades fisicoquímicas requeridas para la autoasociación bidimensional en la interfase agua/aire de una familia de Fmoc-dipeptidos. La capacidad de estos péptidos de autoasociarse en la interfase se ha relacionado por primera vez con los valores del log P y - Log S. D) Se han producido quantum dots (QDs) recubiertos con ácido mercaptopropiónico (MPA) y con los oligopéptidos SS02, SS20 y SS31 funcionalizados con ácido 11-mercaptoundecanóico (MUA). El MPA ha servido como grupo sensible al pH y los oligopéptidos con MUA (MUA-SS02, MUA-SS20 y MUA-SS31) han servido para vehiculizar los QDs modificados al interior de las mitocondrias de diversas líneas tumorales de cáncer de mama. Con esta estrategia se ha podido medir el pH intramitocondrial de dichas células. E) Se han producido hidrogeles de agarosa con nanopartículas de paladio coloidales (PdNPs) ocluidas en su interior, de modo que se ha conseguido retener la difusión libre de las partículas y disminuir su toxicidad, a la vez que se ha mantenido su capacidad catalítica.