Preparación y caracterización de nanomateriales basados en ferritina. Microscopía de fuerzas atómicas para el nanoposicionamiento y reconocimiento molecular de proteínas de superficie

Resumen

La nanociencia y la nanotecnología están presentes en cada vez más ámbitos científicos y, en la mayor parte de los casos, su estudio y aplicaciones se sitúan en un campo multidisciplinar. A lo largo de esta tesis se ha trabajado con varios tipos de proteínas desde diferentes puntos de vista, utilizándolas como nanorreactores para la síntesis de nanopartículas, como vehículos para la nanoestructuración de nanomateriales, o identificándolas en mapas de adhesión a través de la medida de fuerzas de interacción con puntas de AFM funcionalizadas con ligandos afines. Dichas proteínas fueron seleccionadas para este trabajo debido a sus especiales características, que hacen que sean proteínas modelo en diferentes áreas de la biología y la bioquímica. La ferritina, por ejemplo, es una proteína ubicua en la naturaleza, implicada en cantidad de procesos fisiológicos, desde la regulación del metabolismo del hierro, a su participación en procesos como la inflamación. Su estructura y estabilidad frente a cambios bruscos del medio y su capacidad de almacenamiento del hierro y otros elementos en forma cristalina, la diferencian de otras proteínas y la convierten en el nanomolde ideal para la síntesis de nanopartículas de tamaño controlado en su interior. Por otra parte, se ha logrado diferenciar entre receptores de avidina y estreptavidina inmovilizados en una misma muestra a través de la medida de fuerzas con puntas biotiniladas. Al igual que la ferritina, estas interacciones se mantienen incluso en medios extremos, con lo que ha servido de modelo para el estudio de múltiples interacciones entre moléculas biológicas. Finalmente, se ha trabajado con el complejo FNR:Fd, un complejo transitorio de proteínas redox implicadas en la cadena de transporte electrónico de la fotosíntesis en plantas, algas y bacterias. En condiciones de falta de hierro el transporte puede realizarse a través de la Fld, que además comparte zona de interacción con la Fd. Sin embargo, se cree que la interacción FNR:Fld es menos específica que FNR:Fd y los criterios de orientación son menos estrictos. Aunque el proceso de medida de fuerzas entre la enzima FNR y las dos proteínas redox con las que intercambia electrones no se ha concluido a tiempo para esta tesis, se han optimizado los procesos de inmovilización orientada de las proteínas implicadas en muestra y punta, de forma que los sitios de interacción de una de las moléculas esté orientado hacia la otra y viceversa. Estos procedimientos de inmovilización orientada se han demostrado mediante actividad enzimática específica y eficiencia en el establecimiento de enlaces y posterior ruptura por espectroscopia de fuerzas monomolecular (SMFS). Los procedimientos de inmovilización orientada incrementan considerablemente los eventos de ruptura en SMFS, lo que implementa este tipo de experimentos, cuya baja eficiencia general hace que la calidad de los resultados sea baja. Por otro lado, los protocolos diseñados pueden ser utilizados en todo tipo de análisis basados en reconocimiento proteína:proteína. Posteriormente, el estudio de la estabilidad de estos complejos podrá aportar nuevos datos sobre el proceso de la fotosíntesis desde el punto de vista nanomecánico. En esta tesis se ha trabajado con gran variedad de técnicas, desde los métodos bioquímicos clásicos hasta medidas físicas de gran precisión. Entre todas destaca el AFM, debido a la dificultad que supone su adaptación al trabajo con muestras biológicas. Además del AFM propiamente dicho se ha trabajado con una técnica derivada, el DPN, que permite la deposición de forma estructurada de una cantidad de proteína controlada sobre un amplio rango de superficies en condiciones ambientales, sin requerir la funcionalización previa de la muestra o la superficie. El AFM ha ido evolucionando hasta convertirse en una poderosa herramienta para el estudio de los sistemas biológicos. Mediante DPN se pueden diseñar nano-arrays de moléculas biológicas, como proteínas o ácidos nucleicos, de tal manera que se minimizan tanto el área de trabajo como el volumen de muestra, aumentando en cambio la concentración de las moléculas depositadas. De ahí que una de las mayores aplicaciones que puede encontrar el DPN en biología es en el desarrollo de nanosensores basados en la interacción o reconocimiento entre las moléculas de interés.