Desarrollo y aplicación de estrategias metabolómicas mediante técnicas analíticas avanzadas en muestras biológicas

Resumen

RESUMEN La presente memoria recoge los resultados alcanzados durante el desarrollo de la tesis doctoral titulada “Desarrollo y aplicación de estrategias metabolómicas mediante técnicas analíticas avanzadas en muestras biológicas”. En ella, se han desarrollado metodologías basadas principalmente en estrategias metabolómicas no dirigidas para su aplicación en el estudio de compuestos bioactivos así como en el estudio de enfermedades autoinmunes sistémicas. Esta memoria se estructura en dos grandes secciones: introducción y parte experimental. La primera sección de INTRODUCCIÓN describe las principales características de la metabolómica, focalizándose principalmente en la metodología basada en estrategias no dirigidas al ser la aproximación empleada en el desarrollo de la tesis doctoral. En este sentido, se describe el flujo de trabajo de este tipo de estrategias recorriendo el estado actual de todas las etapas implicadas (diseño del estudio, toma y tratamiento de muestras biológicas, adquisición de datos, pre-procesamiento de datos, análisis estadísticos, identificación de metabolitos e interpretación biológica). El enfoque de la descripción de estas etapas está orientado al empleo de cromatografía de líquidos acoplada a espectrometría de masas (HPLC-ESI-QTOF-MS) para estos estudios, al ser la plataforma analítica utilizada en la parte experimental de la memoria. Por último, se detallan los principales campos de aplicación de las estrategias metabolómicas descritas, haciendo hincapié en dos ámbitos, el estudio de enfermedades así como de compuestos bioactivos presentes en alimentos. Por otro lado, la PARTE EXPERIMENTAL incluye los trabajos recopilados en capítulos llevados a cabo a lo largo del periodo predoctoral. Esta sección se divide, a su vez, en dos grandes bloques diferenciados que describen las aplicaciones metabolómicas llevadas a cabo en el ámbito de los compuestos bioactivos (Bloque A) y de las enfermedades autoinmunes sistémicas (Bloque B). El BLOQUE A, centrado en el desarrollo y aplicación de estrategias metabolómicas para el estudio de compuestos bioactivos, incluye en primer lugar una breve introducción sobre los compuestos bioactivos y sus aplicaciones en las áreas de alimentación funcional y nutracéutica. Dentro de este bloque, se incluyen tres capítulos. En el Capítulo 1, se realizó un estudio de absorción intestinal y metabolismo a través de un ensayo de perfusión intestinal in situ, utilizando ratas Wistar como modelo animal. Para ello se utilizó un extracto de romero rico en compuestos bioactivos, el cual ha demostrado poseer un gran potencial anticancerígeno frente a adenocarcinoma de colon. En los Capítulos 2 y 3, se realizaron dos ensayos de intervención nutricional para evaluar el efecto en las rutas metabólicas producido por el consumo de extractos ricos en compuestos bioactivos obtenidos de dos fuentes vegetales alimentarias. Concretamente, en el Capítulo 2, se empleó un modelo animal de ratas diabéticas inducidas por estreptozotocina, a las cuales se les proporcionó durante cinco semanas una dieta rica en compuestos bioactivos extraídos de la pulpa y cáscara de mango cv. “Ataulfo”. La aplicación de una estrategia metabolómica no dirigida en este estudio se llevó a cabo mediante el análisis por HPLC-ESI-QTOF-MS de las muestras de suero sanguíneo e hígado recogidas al final de la intervención. Por su parte, en el Capítulo 3, se llevó a cabo un ensayo de intervención nutricional en humanos con la finalidad de conocer los cambios metabólicos que produce la ingesta de un suplemento alimenticio producido a partir de un extracto de ajo. Para ello, se recolectaron muestras de plasma sanguíneo a 30 voluntarios sanos, antes y después de consumir el suplemento de ajo durante el período de un mes. Estas muestras biológicas se analizaron posteriormente mediante HPLC-ESI-QTOF-MS a través de un enfoque metabolómico no dirigido. El BLOQUE B se centra en la aplicación de estrategias metabolómicas no dirigidas para el estudio de enfermedades autoinmunes sistémicas. Para ello, en primer lugar, se describen brevemente las características de este tipo de patologías. Concretamente, se han estudiado en este bloque siete de estas enfermedades: lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, esclerosis sistémica, síndrome de Sjögren, síndrome antifosfolípido, enfermedad mixta del tejido conectivo y enfermedad mixta del tejido conectivo indiferenciado. Este bloque incluye cuatro capítulos, de los cuales dos de ellos (capítulos 6 y 7) se llevaron a cabo en colaboración con la Universidad de Chalmers (Suecia) gracias a una estancia predoctoral de tres meses en el año 2018 financiada por el Ministerio de Educación, Cultura y Deporte (“Estancias Breves FPU”). En el Capítulo 4, se estudiaron las alteraciones metabólicas encontradas en muestras de plasma sanguíneo y orina de 59 pacientes com esclerosis sistémica. Análogamente, el Capítulo 5 se focalizó en el estudio del síndrome de Sjögren en las muestras tomadas de 43 pacientes. En ambos capítulos, la etapa de pre-procesamiento de datos se realizó mediante el software de la casa comercial de la plataforma analítica utilizada (HPLC-ESI-QTOF-MS), Agilent Mass Profinder. Dada la dificultad observada para pre-procesar los datos metabolómicos adquiridos de un elevado número de muestras con este tipo de software, en el Capítulo 6, se compararon dos metodologías de pre-procesamiento para su aplicación en estudios de metabolómica no dirigida con un elevado número de muestras. Estas metodologías se basaron en la utilización del software comercial mencionado anteriormente y en programas de acceso libre basados en paquetes desarrollados en lenguaje R. Finalmente, el Capítulo 7 se centró en el estudio de las siete enfermedades autoinmunes sistémicas mediante análisis metabolómicos de muestras de orina y de plasma sanguíneo tomadas de 228 voluntarios enfermos y 55 controles sanos. El procesamiento de los datos se realizó mediante la metodología optimizada en el capítulo anterior basada en lenguaje R. SUMMARY The current report encompasses all the results achieved during the development of the PhD Thesis entitled “Development and application of metabolomic strategies through advances analytical techniques in biological samples”. In this thesis, different methodologies have been developed based mainly on untargeted metabolomic strategies for application in the study of bioactive compounds as well as in the study of systemic autoimmune diseases. This report is divided into two main sections: introduction and experimental part. The INTRODUCTION section describes the main characteristics of the metabolomic field, focusing mainly on untargeted strategies since it has been the main approach used in the development of this PhD thesis. In this sense, the workflow of this type of strategy is described, covering the current state of all the stages involved (study design, collection and treatment of biological samples, data acquisition, data pre-processing, statistical analysis, identification of metabolites and biological interpretation). The description of these steps is oriented to the use of liquid chromatography coupled to mass spectrometry (HPLC-ESI-QTOF-MS) for these studies, since it has been the analytical platform used in the experimental part of the thesis. Finally, the main fields of application of metabolomic strategies are detailed, emphasizing two different areas, the study of bioactive compounds and diseases. On the other hand, the EXPERIMENTAL PART includes all studies that have been carried out during the PhD. This part is subdivided in two differentiated subsections that describe the metabolomic applications carried out in the field of bioactive compounds (Section A) and systemic autoimmune diseases (Section B), respectively. SECTION A, focused on the development and application of metabolomic strategies for the study of bioactive compounds, first includes a brief introduction of bioactive compounds and their applications in the areas of functional foods and nutraceuticals. Three chapters are included within this section. In Chapter 1, a study of intestinal absorption and metabolism was performed through an in situ intestinal perfusion assay in Wistar rats. In this study, a rosemary extract rich in bioactive compounds was administered, which has been shown to have a great anticancer potential against colon adenocarcinoma. In Chapters 2 and 3, two nutritional intervention studies were conducted to assess the effect on metabolic pathways produced by the consumption of extracts rich in bioactive compounds obtained from two food sources. Concretely, in Chapter 2, an animal model of streptozotocin-induced diabetic rats was used. The animals received for five weeks a diet rich in bioactive compounds extracted from the pulp and peel of mango cv. "Ataulfo". The application of an untargeted metabolomic strategy in this study was performed by HPLC-ESI-QTOF-MS analysis of serum and liver samples collected at the end of the intervention. In Chapter 3, a nutritional intervention study was carried out in humans in order to know the metabolic changes produced by the intake of a food supplement based on a garlic extract. In this study, blood plasma samples were collected from 30 healthy volunteers, before and after consuming the garlic supplement for a month. These samples were subsequently analysed by HPLC-ESI-QTOF-MS through an untargeted metabolomic approach. On the other hand, SECTION B focuses on the application of untargeted metabolomic strategies for the study of systemic autoimmune diseases. Firstly, the main characteristics of this type of illnesses are briefly described. Specifically, seven of these diseases have been studied in this section: systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, systemic sclerosis, Sjögren's syndrome, antiphospholipid syndrome, mixed connective tissue disease and undifferentiated connective tissue disease. This section includes four chapters, of which two of them (chapters 6 and 7) were carried out in collaboration with the University of Chalmers (Sweden) thanks to a three-month predoctoral stay in 2018 funded by the Spanish Ministry of Education, Culture and Sports (“Estancias breves FPU”). In Chapter 4, the metabolic alterations in plasma and urine samples from 59 systemic sclerosis patients were studied. Similarly, Chapter 5 focused on the study of Sjögren's syndrome in samples collected from 43 patients. In both chapters, the data pre-processing step was performed using the commercial software of the analytical platform used for the analysis (HPLC-ESI-QTOF-MS), Agilent Mass Profinder. Given the observed difficulty in preprocessing the metabolomic data acquired from a large number of samples with this type of software, in Chapter 6, two pre-processing methodologies were compared for application in untargeted metabolomic studies comprising a high number of samples. These methodologies were based on the use of the aforementioned commercial software and open sources based on packages developed in R language. Finally, Chapter 7 focused on the study of seven systemic autoimmune diseases through metabolomic analysis of urine and plasma samples collected from 228 patients and 55 healthy controls. In this chapter, the data-preprocessing step was performed using the methodology optimized in the previous chapter based on R language.