RunX1 en la hematopoyesis embrionaria humana

Resumen

Las células madre embrionarias humanas (CMEH) son un modelo ideal para el estudio de los procesos celulares y moleculares que tienen lugar durante el desarrollo embrionario humano. Obtenidas a partir de embriones humanos en estadios de blastocisto, son capaces de recapitular aspectos del desarrollo embrionario cuando son sometidas a condiciones que las empujan a diferenciarse a distintos tipos celulares. Además de para biología del desarrollo, las CMEH son también muy valiosas como potencial fuente de células maduras funcionales con capacidad para reconstituir órganos o sistemas en individuos con distintas patologías o deficiencias, pudiendo producir número de células a demanda con lo cual se eliminarían restricciones por falta de número de células. La aplicación de las CMEH como terapia celular en medicina regenerativa está empezando a despegar con algunos ensayos clínicos ya en marcha con resultados prometedores, aunque un hándicap que hay que superar es la falta de funcionalidad de algunos tipos celulares obtenidos, como por ejemplo las células madre hematopoyéticas. La hematopoyesis es un proceso que comienza pronto en el desarrollo embrionario y que ha sido ampliamente estudiado en organismos modelo como el ratón o el pez cebra. Durante la hematopoyesis embrionaria se distinguen 2 fases denominadas hematopoyesis primitiva y definitiva, estando compuesta la primitiva por la oleada 1 y la definitiva por las oleadas 2 y 3. En la oleada 1 se producen eritrocitos, macrófagos y megacariocitos primitivos que permiten la oxigenación del embrión y su crecimiento. En la oleada 2 se originan progenitores eritro-mieloides y progenitores linfoides con características fetales y adultas. En la oleada 3 se generan las células madre hematopoyéticas (CMH), que migran al hígado fetal y posteriormente a la medula ósea poco antes del nacimiento donde permanecen de por vida sosteniendo al sistema hematopoyético en adultos. La regulación espacio-temporal de la hematopoyesis es controlada básicamente por factores de transcripción. De entre ellos uno de los más importantes es RUNX1. RUNX1 es un factor de transcripción de la familia Runt, nombre del dominio de unión al ADN conservado entre todos sus miembros a lo largo de la evolución (desde Drosophila hasta humano). Su deficiencia causa muerte en ratones a E11.5-E12.5 debido a la ausencia de hematopoyesis definitiva. En humanos RUNX1 se encuentra frecuentemente mutado o formando parte de translocaciones implicadas en distintos tipos de leucemias, sobre todo leucemia mieloide aguda (LMA) y leucemia linfoide aguda (LLA), subrayando su importancia en la hematopoyesis. Su expresión está regulada mayormente por 2 promotores (distal o P1 y proximal o P2) y por splicing alternativo de sus doce exones, produciendo numerosas isoformas, de las cuales tres son las más estudiadas conocidas como RUNX1a, RUNX1b y RUNX1c. La función de cada una de ellas no está aún muy clara y mucho menos en humanos. Nuestro objetivo básico es estudiar el patrón de expresión y el papel de RUNX1 en la hematopoyesis embrionaria humana usando CMEH como modelo biológico. En primer lugar examinamos la expresión de las isoformas RUNX1a, RUNX1b y RUNX1c durante la diferenciación hematopoyética de CMEH y observamos que RUNX1c es la primera en inducirse, seguida de RUNX1b y RUNX1a. Además, RUNX1c es la única isoforma que se induce en los progenitores hemato-endoteliales (PHE), un tipo celular que puede producir tanto células endoteliales como células hematopoyéticas y que son precursores de los progenitores hematopoyéticos y las CMH. Por todo ello, decidimos estudiar en más profundidad el rol de RUNX1c en la diferenciación hematopoyética. Para ello llevamos a cabo estudios de ganancia (mediante sobre-expresión) y pérdida de función (mediante knock-out y knock-down). La sobre-expresión de RUNX1c potencia la formación tanto de PHE como de progenitores hematopoyéticos (CD34+CD45+) y células hematopoyéticas (CD45+). El aumento en el compromiso desde PHE hacia células hematopoyéticas queda demostrado por un mayor ratio de número de células CD45+ por cada PHE. Este aumento en el número PHE se debe a un efecto de RUNX1c en la diferenciación y no en proliferación o apoptosis. Además de aumentar el porcentaje de dichos tipos celulares también aumenta la capacidad clonogénica de los progenitores hematopoyéticos en ensayos de CFU, aumentando el número de colonias totales. Los tipos de colonias producidos también se ven afectados con una mayor proporción de macrófagos y menor de granulocitos. A nivel molecular también se observa un aumento en la expresión de factores de transcripción hematopoyéticos clave. Para profundizar más en el estudio de la función de RUNX1c en hematopoyesis realizamos la diferenciación de una línea de CMEH deficiente en RUNX1c (knock-out). La deficiencia de RUNX1c no afecta significativamente a la formación de PHE pero sí de forma dramática al posterior compromiso hacia progenitores hematopoyéticos y células hematopoyéticas. El ratio de células hematopoyéticas CD45+ producidas por cada PHE también se ve reducido. Sin embargo, el número de colonias no se ve afectado por la pérdida de expresión de RUNX1c aunque sí los tipos de colonias producidas, con pérdida de potencial granulocítico, disminución de macrófagos y aumento de potencial eritroide. A nivel molecular se observa una disminución de la expresión de factores de transcripción hematopoyéticos. Además, generamos una línea de CMEH con expresión muy reducida de RUNX1 (knock-down) mediante tecnología de ARN interferente (ARNi). El silenciamiento parcial de todas las isoformas de RUNX1 afectan significativamente a la formación de los PHE, no afectando significativamente al compromiso hematopoyético, aunque sí que se observa una reducción en los progenitores hematopoyéticos y células hematopoyéticas. El ratio de células CD45+ por PHE no está significativamente alterado. La reducción en la expresión de RUNX1 disminuye de forma no significativa el número de colonias, a la vez que se observa una pérdida del potencial de diferenciación hacia macrófagos con aumento de potencial granulocítico. Una de las aplicaciones de CMEH es la terapia celular en medicina regenerativa. Hasta el momento no existen protocolos de diferenciación sólidos que permitan la obtención de CMH a partir de CMEH capaces de reconstituir el sistema hematopoyético de ratones inmunocomprometidos. Para superar esta barrera se han definido distintas estrategias y una de ellas es la sobre-expresión de ciertos factores de transcripción que se sabe que son importantes para el desarrollo hematopoyético. Es por ello que evaluamos si la sobre-expresión de RUNX1c era capaz de proveer de capacidad de reconstitución hematopoyética. Desafortunadamente, los derivados hematopoyéticos que sobre-expresan RUNX1 tampoco poseen esta capacidad. Por último, quisimos estudiar los mecanismos moleculares responsables del aumento en la diferenciación hematopoyética promovida por la sobre-expresión de RUNX1c. Para ello realizamos un perfil de expresión génica en PHE durante la diferenciación mediante microarrays. Usando varias herramientas de análisis descubrimos que las categorías de GO (Gene Ontology) con mayor enriquecimiento estadístico están relacionadas con el sistema inmune. Un análisis más en profundidad predice que la sobre-expresión de RUNX1c promueve la activación de genes implicados en varias categorías, de las cuales las más relevantes son reguladores de la diferenciación hacia macrófagos (CSF1, CSF2 y CSF1R) y componentes de la vía de señalización inflamatoria. Mediante reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qRT-PCR) confirmamos que RUNX1c aumenta la expresión de CSF1 y CSF1R, ambos implicados en la diferenciación de macrófagos. Recientemente se han publicado varios estudios que demuestran que la señalización inflamatoria regula la formación de las CMH en ratón y pez cebra. También confirmamos la activación de ciertos componentes de la vía inflamatoria (IFNA2, IRF1, IRF7, STAT2, STAT3 y NFKB1) debido a la sobre-expresión de RUNX1c mientras que la deleción de RUNX1c reduce su expresión. Estos resultados sugieren que RUNX1c promueve la diferenciación hematopoyética a través de la activación de factores de la vía de señalización inflamatoria. La dilucidación de los mecanismos moleculares que controlan la respuesta inflamatoria podría mejorar los protocolos de diferenciación actuales, así como la obtención de CMH funcionales a partir de CMEH.