Edición génica para terapia génica del síndrome de Wiskott-Aldrich

Resumen

Los grandes avances que están teniendo lugar en el campo de la Edición Genómica (EG), particularmente desde la irrupción del sistema CRISPR en éste, están cambiando la forma de abordar la investigación en biología molecular y biomedicina, y plantean un escenario donde estrategias basadas en EG se presenten como alternativa terapéutica para el tratamiento de determinadas enfermedades. Principalmente, podrían verse beneficiadas por este tipo de estrategias ciertas enfermedades monogénicas que hasta la fecha solo cuentan con tratamientos dirigidos a paliar su sintomatología, o para las que acceder a un tratamiento curativo no siempre es posible. En este tipo de afecciones, la reparación del gen alterado mediante EG representa una alternativa prometedora para revertir la enfermedad. Una de las enfermedades para cuyo tratamiento podrían diseñarse estrategias de EG en un futuro es el Síndrome de Wiskott-Aldrich (WAS). WAS es una inmunodeficiencia primaria, de herencia recesiva ligada al cromosoma X, causada por mutaciones en el gen WAS. Este gen codifica para la proteína WASP, específica del linaje hematopoyético, cuyos niveles aparecen ausentes o reducidos en pacientes con WAS. Los afectados muestran inmunodeficiencia celular y humoral, infecciones recurrentes, eczema, microtrombocitopenia con tendencia al sangrado, y propensión al desarrollo de enfermedades autoinmunes y leucemias. La terapia actual para el síndrome de Wiskott-Aldrich incluye el tratamiento de las infecciones, la autoinmunidad, y la trombocitopenia, pero hasta la fecha, el trasplante alogénico de células troncales hematopoyéticas CD34+ obtenidas de médula ósea es el único tratamiento curativo para WAS. No obstante, la falta de donantes para algunos pacientes ha contribuido a la búsqueda de terapias alternativas. La modificación de HSCs mediante terapia génica ex vivo es una alternativa para pacientes que no cuentan con un donante compatible. La corrección de la mutación que causa la enfermedad mediante EG sería, en este sentido, la estrategia ideal. Esto se podría conseguir suministrando a las células diana un DNA donador albergando la secuencia correcta, y aprovechando la vía de reparación del DNA mediante recombinación homóloga (RH). La RH ocurre con baja frecuencia en células somáticas, sin embargo, el desarrollo en los últimos años de varias tecnologías que incrementan la eficiencia de RH hasta 10.000 veces ha hecho posible la utilización de estrategias de EG basadas en RH para terapia génica. Estas estrategias se basan en el uso de endonucleasas específicas de secuencia que inducen roturas en el DNA, cerca del sitio que se quiere modificar. Estas roturas activan los mecanismos con los que cuenta la célula para reparación del DNA, permitiendo la utilización de un DNA donador como molde para reparar el daño ocasionado por la endonucleasa. Dos aspectos fundamentales que deben considerarse para que una estrategia de EG sea trasladable a clínica son eficiencia y seguridad. Una estrategia de EG exitosa debe, por un lado, proporcionar la entrada de las herramientas (nucleasas y DNA donadores) de forma eficiente, en el mayor número de células posible, para alcanzar un beneficio terapéutico. Por otro lado, la modificación de las células dianas debe llevarse a cabo de una forma segura, sin alterar la biología de las mismas. Conseguir eficiencias de EG altas es relativamente sencillo en líneas celulares inmortalizadas, no así en células primarias, cuya modificación resulta más costosa. En células primarias es, por tanto, necesaria una mejora de los sistemas de entrega de las nucleasas y donadores. Nuestra hipótesis es que la mejora de la eficiencia y la seguridad de las herramientas de edición génica permitirán en un futuro cercano la corrección génica en trastornos con base genética, como WAS. Por ello, el objetivo principal de esta tesis era mejorar eficacia y seguridad de las estrategias de EG para WAS.   En nuestro laboratorio contamos con sistemas CRISPR/Cas9 específicos para edición del locus WAS, lo que nos ha permitido comparar, en términos de eficiencia y seguridad, diferentes métodos de entrega para vehiculizar este sistema a las células diana (entrega mediante nucleofección del sistema CRISPR/Cas9 en forma de plásmido, o de ribonucleoproteína preformada, o entrega mediante vectores lentivirales deficientes para integración (IDLV), con la finalidad de utilizar las propiedades de estos vectores para conseguir niveles óptimos y transitorios del sistema CRISPR/Cas9 en las células diana). Estos análisis se llevaron a cabo en la línea celular K562, de linaje hematopoyético, idónea para modelar WAS, y en nuestras células diana, HSCs y células T (atractivas como diana terapéutica para el tratamiento de WAS debido a que su modificación resulta más sencilla en comparación con las HSCs, y presentan un menor riesgo de transformación, y donde la expresión de WASP confiere ventaja selectiva en algunas subpoblaciones). En K562 observamos que los tres métodos de entrega proporcionaban altos niveles de edición, sin que el método de entrega tuviese grandes efectos sobre la especificidad. En HSCs y células T, sin embargo, el único método de entrega que proporcionó niveles de edición del locus WAS robustos fue la entrega del sistema CRISPR/Cas9 en forma de ribonucleoproteína, mediante nucleofección. A pesar de los desalentadores datos de la eficacia de los IDLV en células T y HSCs obtenidos inicialmente, seguíamos teniendo la hipótesis de que mejorando los IDLV podríamos lograr los niveles necesarios del sistema CRISPR/Cas9 para editar de forma eficaz y segura estas células. Previamente, en nuestro laboratorio se había diseñado un elemento aislador (IS2), que en vectores lentivirales había mostrado la capacidad de reducir la variabilidad de la expresión y mejorar los niveles de expresión en células de gran interés. Nos planteamos, por tanto, la inclusión del elemento IS2 en los IDLV para mejorar su comportamiento. Nuestros datos mostraron que la inclusión del elemento IS2 en el 3’LTR del esqueleto lentiviral mejora los niveles de expresión de los IDLV a través de un aumento de 6 a 7 veces en la actividad transcripcional de los episomas de IDLV. Pudimos observar también que el comportamiento mejorado de los episomas IDLV-IS2 probablemente se deba en parte a un reposicionamiento nuclear preferencial en regiones transcripcionalmente activas. Sin embargo, la inclusión de IS2 en el 3’LTR también tenía un efecto negativo en la generación de episomas en las células diana. El efecto final del elemento IS2 en los IDLV dependerá en gran medida de la célula diana y del equilibrio entre los efectos negativos y los efectos positivos en cada tipo de célula. Lamentablemente, en nuestras células diana, las células T y las HSCs, el efecto neto era nulo o negativo, por lo que estos IDLV-IS2 no se pudieron aplicar a nuestro sistema. A pesar de ello el efecto neto positivo encontrado en otros tipos celulares de relevancia como iPSCs, NPCs y neuronas diferenciadas, así como en diferentes líneas inmortalizadas, garantiza la futura aplicabilidad de los IDLV-IS2 en diversas aplicaciones. Por otro lado, durante el curso de esta tesis se han generado dos modelos que permiten analizar eficiencia y seguridad de reparación mediante RH de sistemas CRISPR/Cas9 específicos para WAS. Estos modelos nos han permitido concluir que las integraciones del DNA donador en sitios indeseados depende del diseño del DNA donador y del número de dianas en el genoma de la célula. Por otro lado, nos han permitido observar que los DNA donadores que incluyen la diana de corte mejoran la eficacia de RH sin incrementar la inespecificidad. Con todos estos antecedentes, en la parte final de la tesis se procedió a abordar la edición genómica del locus WAS en células T y HSCs utilizando los sistemas que mejores resultados nos habían dado en nuestros modelos. Estos datos mostraron que la nucleofección de complejos ribonucleoproteicos (gRNA-Cas9) es el método de elección para la EG de células T y HSCs, y que combinándolo con donadores como productos de PCR, permite editar el locus WAS en HSCs y células T. Sin embargo la eficiencia es todavía mejorable y pudimos detectar varios cortes en sitios fuera de diana, tanto en las células T como en las HSCs. Por lo tanto, aunque la EG es un abordaje interesante y posible para llevarlo a clínica para el tratamiento de WAS, requiere de nuevas optimizaciones para incrementar la eficacia y la seguridad.