Brain carboxylesterases interacting with organophosphorus compoundskinetic characterization and approaches to purification and molecular identification

Resumen

Los compuestos organofosforados (OPs) constituyen un amplio grupo de compuestos químicos utilizados con diversos fines (plaguicidas, agentes de guerra, retardantes de llama, ectoparasiticidas, medicamentos en investigación, etc.). Los OPs pueden causar varios efectos neurotóxicos: (i) la toxicidad colinérgica aguda debida a la organofosforilación de la enzima acetilcolinesterasa, (ii) la neuropatía retardada inducida por organofosforados (OPIDN) causada por la inhibición y posterior envejecimiento de la enzima esterasa diana de neuropatía (NTE), (iii) efectos neuroconductuales y neuropsicológicos crónicos se han asociado con una exposición a dosis medio-bajas de OPs, que no se puede explicarse con las moléculas diana conocidas; ( iv) la potenciación de OPIDN , cuya molécula diana se desconoce. Potencialmente, muchos sistemas enzimáticos podrían interaccionar con los OPs. La mayoría de las moléculas diana de los OPs se han encontrado en la familia de enzimas serina esterasas. Recientemente se han desarrollado los modelos cinéticos que permiten la detección de esterasas que se unen a OPs en preparaciones biológicas complejas donde se dan distintas reacciones concomitantemente y hay varios sistemas enzimáticos. En este trabajo, se han detectado las esterasas de cerebro de pollo (de las fracciones solubles y de membrana) que hidrolizan fenilvalerato esterasa. Éstas se han discriminado cinéticamente con los inhibidores mipafox (inductor de OPIDN), paraoxon (no inductor) y PMSF (potenciador de OPIDN). Se han caracterizado siete componentes esterásicos con diferentes comportamientos cinéticos. Cuatro son de mebrana (EP¿ , EPß, EP¿ y EP¿) y tres son citosólicos (E¿, Eß y E¿). EP¿ se atribuye a la enzima NTE dado sus propiedades cinéticas, éste es el único componente detectado para el cual se han identificado roles toxicológicos y biológicos, y esta molecularmente y genómicamente caracterizado. El papel toxicológico y biológico de los otros seis componentes se desconoce, además cada uno podría estar formado por una o varias enzimas con propiedades similares. Sin embargo, las interacciones observadas con los inhibidores revelan que puedan estar relacionados con la neurotoxicidad de OPs. Los componentes E¿ y EP¿ podrían desempeñar un papel en la toxicidad a bajas dosis y largo plazo de OPs, debido a su alta sensibilidad y a que pueden ser espontáneamente reactivados después de la inhibición con paraoxon. Los componentes Eß y EPß podrían jugar un papel en la potenciación de OPIDN ya que son sensibles a PMSF y resistentes a mipafox. Además se ha observado en los componentes E¿ y E¿ que la exposición a concentraciones no inhibitorias a los inhibidores disminuye la sensibilidad al mipafox, PMSF o paraoxon. Esto sugiere una modificación irreversible de los inhibidores en otro sitio de unión al del sustrato. Estas interacciones podrían ser pertinentes para interpretar fenómenos de potenciación y en la comprensión de los efectos neurotóxicos de exposiciones a múltiples xenobióticos. Gracias a esta discriminación cinética se ha establecido un ensayo sencillo que permite la discriminación de todos los componentes enzimáticos. Se ha desarrollado un método de semifraccionamiento de los componentes esterásicos en la fracción soluble de cerebro mediante varias etapas en cromatografía preparativa de alta resolución. Mediante el cual la fracción soluble de cerebro de pollo se separó en tres fracciones diferentes por cromatografía de exclusión molecular. Cada una de estas fracciones se separo posteriormente en más de cinco por cromatografía de intercambio aniónico se obtuvieron fracciones enriquecidas con los componentes enzimáticos de interés toxicológico. Cuando el mismo procedimiento de semifraccionamiento se llevó a cabo con muestras pretratadas con mipafox se obtuvieron perfiles cromatográficos diferentes, sugiriendo que el tratamiento con mipafox modifica las propiedades iónicas de un amplio número de proteínas. Se obtuvo una alta actividad específica para el componente E¿ en una de las fracciones, en la que se realizó un ensayo preliminar de identificación de proteínas por espectrometría de masas. Se identificaron 259 proteínas en la muestra de acuerdo con los datos genómicos, demostrando que las muestras obtenidas en el procedimiento de fraccionamiento son apropiadas para el análisis proteómico. Mediante un análisis bioinformático de la lista de proteínas se encontró la enzima butirilcolinesterasa como potencial diana de los efectos cinéticos observados en esa fracción, ya que es la única de las 259 proteínas que posee potencial actividad esterásica. Sin embargo no puede descartarse que cualquiera del resto de proteínas presentes en la muestra pudiera ser responsable de la actividad enzimática. La identificación molecular de todo este grupo de enzimas responsables de la actividad fenilvalerato esterasa y de la interacción con los inhibidores es un objetivo a largo plazo de nuestro laboratorio y estos resultados están siendo aplicados en actuales estudios de purificación e identificación molecular.