Papel de la esterasa diana de neuropátia (nte) y su gen codificante (pnpla6) en el desarrollo y la diferenciación celular in vitro

Resumen

Papel de la esterasa diana de neuropátia (nte) y su gen codificante (pnpla6) en el desarrollo y la diferenciación celular in vitro resumen la esterasa diana de la neuropatía (nte) fue inicialmente identificada como la diana de algunos compuestos organofosforados que causan la denominada neuropatía retardada inducida por organofosforados. Algunos estudios in vivo indican que esta proteína también podría jugar una importante función en el desarrollo embrionario y por lo tanto también en la diferenciación celular. El objetivo de esta tesis es estudiar el papel de nte y de su gen codificante (pnpla6) en la diferenciación celular. Las células madre embrionarias (esc) de ratón d3 y r1 y las células humanas embrionales tumorales derivadas de ntera2/cl.D1 (hnt2) expresaron actividad enzimática nte. Además, las células d3, hnt2 y las esc humanas h9 también expresaron el gen pnpla6 aun en su estado más indiferenciado. Las esc d3 y h9 aumentaron entre 4 y 5 veces la expresión de pnpla6 durante las primeras etapas de la diferenciación espontánea volviendo la expresión del gen al nivel de las células indiferenciadas aproximadamente en el día 5 del proceso. Sin embargo, la expresión del gen pnpla6 en células hnt2 aumentó de manera progresiva con el tiempo conforme las células se iban diferenciando a células neuronales y gliares alcanzándose un máximo de expresión de unas 200 veces el nivel de las células indiferenciadas hacia el día 35. El silenciamiento de pnpla6 en esc d3 en diferenciación espontánea con rna silenciador (sirna) específico redujo la expresión del gen un 80% y la actividad enzimática nte un 50% a las 48 y 30 horas del tratamiento, respectivamente. Este silenciamiento también alteró la expresión de 545 genes 96 horas después de la exposición al sirna. El análisis de los procesos más alterados por el silenciamiento de pnpla6 mostró que las rutas más afectadas eran las implicadas en el desarrollo del organismo, ensamblaje celular, organización celular y desarrollo del sistema nervioso. Estos análisis también sugirieron que pnpla6 podría tener un papel relevante en la homeostasis de los lípidos y la vasculogénesis. El silenciamiento de pnpla6 en hnt2 en diferenciación dirigida a neuroectodermo redujo la expresión del gen un 97% y la actividad enzimática nte un 60% a las 24 y 96 horas del tratamiento con el sirna, respectivamente. En estos mismos puntos de la diferenciación (días 1 y 4 del proceso) el número de genes alterados por el silenciamiento fue de 28 y 394, respectivamente. Las rutas funcionales alteradas estuvieron relacionadas con la formación de epitelio, la neurogénesis, y los procesos del desarrollo. Además, el número de neuronas encontrado en cultivos de células hnt2 silenciadas tras 13 días de neurodiferenciación disminuyó un 80% con respecto al de los cultivos control, encontrándose además grandes alteraciones morfológicas en células nerviosas maduras tras 66 días de diferenciación. La inhibición crónica de nte por el organofosforado neuropático mipafox en células hnt2 en neurodiferenciación no causó alteraciones genotípicas ni fenotípicas destacables. En conclusión, se ha demostrado que nte y pnpla6 están implicados en la diferenciación y el desarrollo embrionario al ser imprescindibles para la formación del sistema nervioso, vascular y el desarrollo de la placenta.