Estudios estructurales de proteínas diméricas entrecruzadasimplicaciones biológicas del desplazamiento de dominios

Resumen

El dominio SH3 de la c-Src tirosina quinasa (c-Src-SH3) forma dímeros entrecruzados y fibras amiloides en condiciones ácidas de pH. En esta tesis, demostramos que la mutación del residuo Gln128 de este dominio produce un efecto significante en la estabilidad térmica del mismo y afecta a la tendencia de formación de amiloides. El mutante Gln128Glu forma fibras amiloides a pH neutro, no haciéndolo a pH ácido, mientras que los mutantes Gln128Lys y Gln128Arg no forman amiloides bajo ninguna condición ensayada. También hemos resuelto las estructuras cristalográficas del dominio c-Src-SH3 en su forma nativa (WT) y los mutantes Gln128Glu, Gln128Lys y Gln128Arg a diferentes pHs. A pH 5 los cristales obtenidos pertenecen al grupo espacial hexagonal P6522 y la unidad asimétrica está compuesta por una cadena del protómero del dominio c-Src-SH3 en su conformación abierta. A pH7, los cristales pertenecen al grupo espacial ortorrómbico P212121, con dos moléculas en la unidad asimétrica mostrando el plegamiento característico del los dominios SH3. El análisis de estas estructuras cristalinas pone en evidencia que el residuo en la posición 128 se encuentra conectado con el Glu106 del giro divergente beta a través de una agrupación de moléculas de agua. Los cambios en esta red de puentes de hidrógeno pueden llegar a producir un desplazamiento del lazo distal, generando cambios en el residuo Leu100 que están relacionados con la unión de secuencias ricas en prolina (SRP). Nuestros descubrimientos ponen en evidencia que la interacción electróstática y solvatación de ciertos residuos cercanos al núcleo de plegamiento del dominio c-Src-SH3 juegan un papel clave durante la reacción de plegamiento y la formación de fibras amilodies. Para poder caracterizar a fondo el mecanismo de unión de estas SRP al dominio c-Src-SH3, se obtuvieron las estructuras cristalinas a resolución atómica de los complejos del dominio con dos péptidos de alta afinidad de orientación tipo I y II. Los cristales de los complejos con el péptido de clase II denominado APP12 (APPLPPRNRPRL) pertenecen al grupo espacial trigonal P3121 y la unidad asimétrica está compuesta por una sola molécula de proteína y de péptido. Los cristales del dominio c-Src-SH3 con el péptido de clase I denominado VSL12 (VSLARRPLPLP) pertenecen al grupo espacial trigonal P3221 y la unidad asimétrica se compone también de una sola molécula de ambos. Los cristales fueron obtenidos en presencia de PEG 300 bajo las mismas condiciones de cristalización del dímero entrecruzado, pero la presencia del péptido estabiliza la forma monomérica. La alta calidad de estas estructuras permite un análisis detallado de los puentes salinos, las interacciones del tipo catión-pi y de los puentes de hidrógeno en la interfaz de unión de estas SRP al dominio c-Src-SH3. Además, estas estructuras permiten identificar moléculas de agua presentes en dicha unión para poder ser estudiadas por primera vez. También hemos resuelto la estructura del complejo con el péptido natural PP2.2-NS5A, que pertenece a la proteína no estructural NS5A del virus de la hepatitis C, con la proteína WT. Esta estructura no solo nos proporciona información de cómo se produce la interacción de esta SRP natural con el dominio c-Src-SH3, si no que a su vez es una confirmación de la interacción propuesta por Schwarten a partir de los experimentos de valoración. Al comenzar los estudios que se incluyen en esta tesis, se había comprobado experimentalmente la interacción de la proteína NS5A con varios dominios SH3 de la familia de la Src-tirosina quinasa: Hck, Lyn, LcK y Fyn. Por otra parte, también se había demostrado que la Src tirosina quinasa intervenía en la formación del complejo entre las proteínas víricas NS5A/NS5B, pero la interacción se produce de forma que la proteína NS5A lo hace a través del dominio SH2 y la NS5B a través del dominio SH3. La formación de este complejo es importante ya que es necesario para la replicación del ARN. Sin embargo los estudios realizados en el año 2013 mediante técnicas de valoración con péptidos seguidas por RMN indicaban la interacción del dominio de la c-Src con una SRP presente en la proteína NS5A. Esta proteína no estructural contiene tres SRP, denominadas PP1 (K26LMPQLP32) de clase I y PP2.1 (P343LPPTKA349) y PP2.2 (A349PPIPPPRRKR359) de clase II. De estas secuencias, la del carboxilo-terminal (PP2.2) se encuentra conservada entre los diferentes genotipos del virus de la hepatitis C, y se ha propuesto que participa en la persistencia del virus alterando el entorno celular. Los cristales obtenidos a pH neutro pertenecen al grupo espacial I41, con una sola molécula en la unidad asimétrica del complejo c-Src-SH3/PP2.2-NS5A. El péptido se encuentra unido en una orientación tipo II y la comparación de esta estructura con las anteriores resueltas con los péptidos APP12 y VSL12 revelan diferencias importantes en la región del puente salino que dirige la orientación del péptido. Otros cambios conformacionales en residuos colocados lejos del sitio de unión también juegan un papel importante en la orientación de unión de este péptido