La mutagénesis insercional como herramienta genómica en tomateaislamiento y análisis funcional del pod1 , un regulador clave para el desarrollo del polen

Resumen

Las técnicas de secuenciación de nueva generación (NGS) han permitido la determinación de la secuencia del genoma de multitud de especies, resultados complementados por los análisis bioinformáticos que han hecho posible anotar los genes y predecir multitud de nuevos modelos génicos. En la actualidad, los esfuerzos científicos se centran en completar el vacío existente entre las predicciones in silico de nuevos genes y los estudios de genómica funcional de todos esos potenciales genes de un genoma. Es por ello que, entre las herramientas genómicas para identificar la función de los genes, la generación y análisis de las variaciones fenotípicas y genotípicas se postulan como fundamentales, siendo las colecciones de mutantes una valiosa fuente de recursos genéticos y, en este sentido, hay que destacar a la mutagénesis insercional porque hace posible la aplicación tanto de estrategias de genética reversa como directa. En este trabajo se caracteriza fenotípica y molecularmente una colección de más de 7.800 mutantes insercionales generados mediante transformación con Agrobacterium tumefaciens y el vector pD991, en dos variedades comerciales de tomate (Solanum lycopersicum L.), Moneymaker y P73. Un total de 4.189 líneas T1 y 1.858 familias T2 han sido evaluadas fenotípicamente y en ellas se han identificado 522 mutantes (205 dominantes, 274 recesivos y 43 que no siguen un patrón de herencia mendeliano) afectados en diferentes aspectos del desarrollo vegetativo y/o reproductivo. Los análisis moleculares han demostrado que el número medio de inserciones de T-DNA en los mutantes de la colección es de 2,01 ± 0,91. Y aunque la mayoría de estas inserciones se localizaron en regiones anotadas como intergénicas, un 37,7% de las inserciones se localizan en regiones codificantes de genes o en sus promotores. Como prueba de la utilidad de la colección de mutantes en el análisis funcional del genoma de tomate, hemos caracterizado los mutantes 2477ETMM y 1381ETMM. En el primero de ellos, la integración de un T-DNA en la región codificante del gen que codifica para la enzima UTP-glucosa-1-fosfato uridiltransferasa, provoca una alteración en el desarrollo de la hoja y la senescencia prematura de los foliolos, un fenotipo muy similar al que muestran los mutantes del gen homólogo de Arabidopsis. Por su parte, la caracterización del mutante 1381ETMM nos ha permitido comprobar que la disminución en el tamaño de las hojas y frutos de este mutante está causada por la inserción de un T-DNA en el gen LYRATE. La identificación de este nuevo alelo puede ayudar a profundizar en el conocimiento de las funciones de este gen en el desarrollo de la planta. Además, durante el análisis de la colección de mutantes para caracteres relacionados con el desarrollo y maduración del polen hemos identificado al mutante pollen deficient 1 (pod1), que produce polen inviable y, como consecuencia de ello, frutos partenocárpicos. El estudio histológico detallado de las anteras de las plantas pod1 ha mostrado que la malformación del polen comienza en el estadio de microspora, con un importante retraso en la degradación del tapetum, lo que ocasiona una descoordinación temporal que impide la correcta maduración del polen. El análisis molecular reveló que un único T-DNA era causante de la mutación pod1 y la clonación de las regiones flanqueantes mostraron que el T-DNA se localizaba en el cromosoma 6, en una región promotora de dos genes dispuestos en orientación inversa, que codifican para un factor de transcripción tipo Zinc Finger HIT (ZNHIT) y para la subunidad 18 del COMPLEJO MEDIADOR de la RNA POLIMERASA II (SlMED18). La caracterización de ambos genes ha demostrado que el fenotipo pod1 está causado por la desregulación de la expresión del gen SlMED18. Los resultados indican que SlMED18 es un regulador transcripcional de un conjunto de genes implicados en el desarrollo del polen. La sobreexpresión de SlMED18 complementa los fenotipos mutantes de tiempo de floración y falta de identidad de órganos florales del mutante med18 de Arabidopsis, lo que demuestra que estos genes comparten una homología funcional. No obstante, los resultados indican que el control genético que realiza el gen SlMED18 sobre el desarrollo y formación del polen se debe a una divergencia funcional ocurrida durante el proceso evolutivo de tomate.