Métodos biotecnológicos para la producción de diferentes alfa- y beta- aminoácidos mediante cascadas quimioenzimáticas

Resumen

Debido a que la evolución eligió el L-isómero para el inicio de la vida, el estudio de los D-¿-aminoácidos ha quedado relegado a un segundo plano durante décadas. Sin embargo, los D-¿-aminoácidos son cada vez más importantes como sintones en la industria, no sólo por su importancia como componentes de antibióticos naturales y semisintéticos, sino también por su menor tasa de degradación y lenta velocidad de asimilación en comparación con el correspondiente L-¿-aminoácido, además del descubrimiento de otras muchas aplicaciones. Por este motivo, la obtención de procesos eficaces para su producción económica seguirá siendo de interés en el futuro. Entre los distintos métodos de síntesis química y quimioenzimática de D-¿-aminoácidos ópticamente puros, el ¿Proceso de la Hidantoinasa¿ es uno de los procedimientos más baratos, sencillos, eficaces y con mayor rendimiento, además de ser respetuoso con el medio ambiente. En dicho proceso la enzima D-hidantoinasa abre el anillo de las hidantoínas D,L-5-monosustituidas hasta el correspondiente N-carbamil-¿-D-aminoácido. Posteriormente, la enzima N-carbamil-D-aminoácido amidohidrolasa hidroliza este compuesto para dar NH3, CO2 y el D-¿-aminoácido libre. A la vez que la D-hidantoinasa hidroliza selectivamente el D-isómero del sustrato, comienza la racemización química y/o enzimática del otro isómero no hidrolizado, de forma que el rendimiento del proceso es del 100%. En el año 2002, Martínez-Rodríguez y colaboradores desarrollaron un sistema de producción de D-¿-aminoácidos ópticamente puros basado en el ¿Proceso de la Hidantoinasa¿ que incluía la racemización enzimática del L-isómero del sustrato no hidrolizado. Éste consistía en una reacción en tres pasos llevada a cabo por las enzimas recombinantes expresadas en E. coli y de forma independiente: hidantoín racemasa, D-hidantoinasa y N-carbamil-D-aminoácido amidohidrolasa. En el trabajo que aquí se presenta se han construido dos sistemas policistrónicos que permiten la co-expresión con un único promotor de las tres enzimas en la misma célula. Ambos sistemas están formados por la D-hidantoinasa y N-carbamil-D-aminoácido amidohidrolasa de Agrobacterium tumefaciens BQL9, y la hidantoín racemasa 1 de A. tumefaciens C58 para el sistema 1 y la hidantoín racemasa 2 del mismo organismo para el sistema 2. El gen de la N-carbamil-D-aminoácido amidohidrolasa ha sido clonado adyacente al promotor del plásmido con el fin de obtener un nivel más alto de enzima, evitando así la acumulación del intermedio N-carbamil-D-aminoácido, que ralentiza la velocidad de reacción. Ambos sistemas son capaces de convertir totalmente diferentes mezclas racémicas de hidantoínas 5-monosustituidas hasta los D-¿-aminoácidos ópticamente puros, metionina, leucina, norleucina, norvalina, ácido aminobutírico, valina, fenilalanina, tirosina y triptófano. Para la producción de la mayor parte de los D-¿-aminoácidos estudiados, el sistema 1 hidroliza más rápidamente el sustrato que el sistema 2. Por otro lado, la síntesis química de los ß-aminoácidos ha atraído la atención de numerosas científicos durante los últimos años debido a la amplia variedad de propiedades farmacológicas que presentan, ya sea en su forma libre o como componentes de una gran variedad de productos naturales. Además, los péptidos formados por ß-aminoácidos presentan una serie de ventajas frente a los formados por ¿-aminoácidos, como son su mayor estabilidad al metabolismo y a enzimas proteolíticas, una degradación microbiana lenta y la formación de estructuras secundarias bien ordenadas. A todo esto hay que añadir que pueden imitar a los ¿-péptidos en interacciones péptido-proteína y proteína-proteína. Sin embargo, el uso de estos aminoácidos se ve limitado por la falta de métodos de obtención generales, siendo esto aún más determinante en el caso de los ß2-aminoácidos. Asimismo la síntesis enzimática de estos compuestos ha recibido una menor atención. En la naturaleza, la degradación reductiva de pirimidinas representa la principal ruta de obtención de los ß-aminoácidos naturales ß-alanina y ácido ß2-aminoisobutírico. En el primer paso la enzima dihidropirimidina deshidrogenasa reduce la base pirimidínica (usando NADH o NADPH) hasta el correspondiente derivado 5,6-dihidrouracilo. En ese momento la enzima dihidropirimidinasa hidroliza el anillo pirimidínico, dando lugar al N-carbamil-ß-aminoácido. Finalmente la enzima ß-ureidopropionasa cataliza la hidrólisis de este compuesto hasta NH3, CO2 y el ß-aminoácido correspondiente. En la presente tesis doctoral se propone un método de producción de ß2- y ß3-aminoácidos a partir de su correspondiente dihidrouracilo 5- ó 6-monosustituido a través de un proceso bienzimático basado en el tándem dihidropirimidinasa/ß-ureidopropionasa. Con este fin se ha llevado a cabo una caracterización exhaustiva de la ß-ureidopropionasa de Agrobacterium tumefaciens C58 y se ha estudiado la especificidad de sustrato de la dihidropirimidinasa de Sinorhizobium meliloti CECT4114. En último lugar se ha evaluado la posibilidad de producir ß-aminoácidos a través de un biocatalizador formado por ambas enzimas purificadas. Nuestros resultados demuestran por primera vez que esta estrategia constituye una interesante herramienta biotecnológica para la preparación de diferentes ß-aminoácidos de una manera respetuosa con el medio ambiente, permitiendo la producción de ß-alanina, ß3-homoalanina, ácido ß2-aminoisobutírico y (R)-ß2-fenilalanina.