Ensayos de cria in vitro y caracterizacion bioquimica y molecular de la actividad proteolitica de la mosca blanca bemisia tabaci (gennadius, 1889)

Resumen

PARTE DEL TRABAJO REALIZADO EN ESTA TESIS DOCTORAL HA SIDO ORIENTADO A OPTIMIZAR Y DESARROLLAR LAS CONDICIONES ADECUADAS PARA LA CRÍA IN VITRO DE B. TABACI. HAN SIDO UTILIZADOS DISTINTOS TIPOS DE ALIMENTADORES Y MEMBRANAS, ASI COMO DIFERENTES TIPOS DE DIETAS PARA EVALUAR LA ACEPTABILIDAD POR PARTE DE LAS MOSCAS BLANCAS, LA OVOPOSICIÓN Y EVALUAR LA SUPERVIVENCIA DE ESTE HOMÓPTERO. POR OTRO LADO SE HA PUESTO A PUNTO UNA NUEVA METODOLOGÍA, BASADA EN SUSTRATOS FLUOROGÉNICOS DERIVADOS DE LA RODAMINA-110, PARA DETECTAR ACTIVIDADES PROTEOLÍTICAS EXTREMADAMENTE BAJAS. UTILIZANDO ESTE METODOLOGÍA Y CON LA LA AYUDA DE INHIBIDORES COMERCIALES HA SIDO POSIBLE DETECTAR Y CARACTERIZAR LA ACTIVIDAD PROTEOLÍTICA DE B. TABACI. CON ESTOS ENSAYOS, SE HA PUESTO DE MANIFIESTO QUE ESTA ESPECIE POSEE UNA AMPLIA BATERÍA DE ENZIMAS PROTEOLÍTICAS QUE INCLUYE CISTEÍN, SERÍN Y METAL PROTEASAS ADEMAS DE PROTEASAS DE TIPO ASPÁRTICO. MEDIANTE ZIMOGRAFÍA SE HA PODIDO CONFIRMAR QUE LA ACTIVIDAD PREDOMINANTE EN EXTRACTOS CRUDOS DE ESTA ESPECIE ES DE TIPO CISTEÍN PROTEASA. TAMBIEN MEDIANTE ZIMOGRAFÍA SE HA PODIDO CONSTATAR LA PRESENCIA DE ACTIVIDAD PROTEOLÍTICA DESDE LOS PRIMEROS ESTADIOS NINFALES, OBSERVANDOSE QUE EL EQUIPAMIENTO DE PROTEASAS ES MÁS COMPLEJO A MEDIDA QUE LA NINFA SE APROXIMA AL ESTADO ADULTO. POR ÚLTIMO, PARA CONFIRMAR LA PRESENCIA DE ACTIVIDAD TRIPSINA Y SU ORIGEN DIGESTIVO SE HAN UTILIZADO TÉCNICAS MOLECULARES, LO QUE HA PERMITIDO CONFIRMAR SU SIMILITUD CON LAS TRIPSINAS DE OTROS ARTRÓPODOS. ESTE HECHO EVIDENCIA TRES COSAS IMPORTANTES: 1) QUE B. TABACI POSEE ACTIVIDAD PROTEOLÍTICA; 2) QUE LA TRIPSINA ES SINTETIZADA POR EL PROPIO ORGANISMO Y NO POR ENDOBACTERIAS SIMBIONTES: Y 3) QUE LA SECUENCIA ANALIZADA SE CORRESPONDE CON LA DE UNA TRIPSINA DIGESTIVA.