La mutagénesis como herramienta de genómica funcional en tomateCaracterización de los mutantes succulent stamens2 y hairplus

Resumen

A lo largo de las pasadas décadas se han realizado numerosos avances en el estudio genético de especies hortícolas principalmente para tratar dar respuesta a los retos que enfrenta la agricultura en la actualidad. Entre estos desafíos destacan la presión que ejerce el cambio climático sobre los modelos de cultivo establecidos, así como el incremento de la población mundial. Con este fin, el desarrollo de nuevas variedades comerciales capaces de hacer frente a un entorno cambiante se revela como la alternativa más eficaz. Sin embargo, la variabilidad natural en especies cultivadas parece no ser suficiente para superar todos esos retos. Es por ello que la ONU, además de declara la década 2011-2020 “Década de la ONU sobre Diversidad" ha encargado a la FAO que se implique en impulsar programas de creación de diversidad mediante distintas estrategias de mutagénesis. Solo así podremos continuar desarrollando variedades más productivas a la par que resistentes a estrés bióticos y abióticos. Entre los cultivos hortícolas de mayor relevancia a nivel mundial destaca el tomate (Solanum lycopersicum L.), cuya demanda aumenta continuamente debido a sus propiedades nutricionales y a sus numerosas formas de consumo. Esta especie es además un excelente modelo génico para comprender el desarrollo de plantas de fruto carnoso, ya que presenta enormes ventajas como una elevada tasa de productividad, un ciclo de vida relativamente corto y caracteres agronómicos muy favorables como una elevada tolerancia a estreses abióticos. Todo ello propició que en 2012 un consorcio internacional completara la secuenciación de su genoma, lo que ha permitido realizar enormes progresos en la comprensión de la organización genómica de esta especie. Sin embargo, del total de genes identificados, sólo el 70% aproximadamente tiene una función génica asignada, basada en homologías de secuencias y predicciones in silico. De ahí que los esfuerzos actuales se centren en completar la asignación de nuevas funciones génicas mediante estrategias de genómica funcional. Una de las estrategias de genómica reversa más ampliamente utilizada para la identificación de nuevos genes y su caracterización funcional es el estudio de mutantes, que constituyen un valioso recurso genético y una enorme fuente de variabilidad. La mutagénesis ha sido ampliamente utilizada en tomate y otras hortícolas y el uso de agentes mutagénicos químicos en particular, constituye una de las estrategias más comúnmente utilizada. Entre las principales ventajas de estas sustancias destaca que son fáciles de manipular y relativamente inocuas. Entre estos agentes se encuentran las sustancias alquilantes como el etil metil sulfonato (EMS), que ha demostrado ser altamente efectivo en la inducción de mutaciones en plantas. Habida cuenta de la enorme utilidad del EMS, en el presente trabajo se ha obtenido y caracterizado una colección de mutantes empleando este agente mutagénico en el cultivar Moneymaker de tomate. Se han caracterizado alrededor de 8988 plantas mutantes pertenecientes a esta colección, entre las que se han observado alteraciones fenotípicas relevantes de la morfología de la hoja, el tamaño y hábito de crecimiento de la planta, así como alteraciones de la morfología y color de flores y frutos. La combinación de esta estrategia de mutagénesis con técnicas de secuenciación masiva nos ha permitido caracterizar nuevas funciones génicas de enorme interés para comprender en profundidad el desarrollo vegetativo y reproductivo de tomate. Entre los mutantes identificados como parte de esta colección se encuentra el mutante succulent stamens2 (sus2), que se caracteriza por una morfología floral alteradas, en lo referente a los pétalos y en especial los estambres que están mal formado. Como consecuencia, las plantas mutantes no producen polen y sus frutos son partenocárpicos (sin semillas) y de menor tamaño. Además, durante el desarrollo y la maduración del fruto los estambres se convierten en carpelos carnosos que permanecen adheridos al fruto de las plantas mutantes. El análisis de la morfología de los estambres de plantas mutantes mediante microscopía electrónica de barrido reveló que estos experimentan una conversión homeótica completa en carpelos, así como alteraciones homeóticas parciales en la morfología de las células epidérmicas de los pétalos. La identificación de la localización cromosómica de la mutación sus2 se realizó mediante mapeo genético utilizando marcadores codominantes en combinación con una estrategia de mapeo por secuenciación. Ello nos permitió identificar dicha mutación en un exón del factor de transcripción TOMATO MADS-BOX 6 (TM6), un gen de clase B implicado en el control de la identidad de los órganos florales del segundo y tercer verticilo. Como resultado de la pérdida de función de TM6, la expresión de otros genes MADS box implicados en el desarrollo floral está alterada en el mutante sus2, lo que demuestra que TM6 es crucial para el mantenimiento de la función de clase B, así como para el correcto funcionamiento de otras proteínas implicadas en la morfogénesis floral, función previamente hipotetizada por algunos autores, pero puesta en tela de juicio por otros. Por otra parte, durante la caracterización de la colección se identificó también un mutante al que hemos denominado hairplus (hap), ya que muestra una elevada densidad de tricomas. Este fenotipo es particularmente evidente en los tallos vegetativo y de las inflorescencias, y resulta de enorme interés ya que se ha demostrado que existe una correlación positiva entre el incremento de la densidad de tricomas y la resistencia a plagas de herbívoros. Además, la mutación hap incrementa específicamente la densidad de los tricomas glandulares de tipo I, como se deduce del análisis realizado en plantas de fenotipo silvestre y plantas mutantes. La localización cromosómica de la mutación se realizó mediante una estrategia combinada de cartografía genética y mapeo por secuenciación. De esta forma, se localizó la mutación en una Histona N-Lisina Metil Transferasa, una proteína relacionada con el control epigenético de la expresión génica mediante la metilación de histonas. De este modo, la regulación de la densidad de tricomas constituye una nueva función génica identificada para este grupo de proteínas. Por otra parte, el análisis de la densidad de tricomas en líneas de pérdida (RNAi y CRISPR) y de ganancia de función (35S) confirmaron que la mutación identificada es la responsable del fenotipo mutante hap. Finalmente, como resultado de la mutación se producen numerosas modificaciones del transcriptoma y del epigenoma de plantas mutantes, que incluyen la expresión diferencial de 92 genes, así como 2113 citosinas diferencialmente metiladas. Todo ello demuestra que HAP es un regulador clave de la densidad de tricomas de tomate mediada por la regulación epigenética de la expresión génica, lo cual supone la primera demostración de este tipo de control en un carácter del mayor interés agronómico.