Caracterización de una hemo peroxidasa extracelular de pseudomonas putidasu papel en resistencia a estrés oxidativo y biocontrol

Abstract

El entorno de la raíz junto a la región del suelo que la rodea constituye la rizosfera. Esta zona se halla bajo la influencia de la raíz y de los exudados radiculares, que son ricos en nutrientes, y presenta una alta actividad microbiológica. Aunque la densidad bacteriana es mayor en la rizosfera que en el suelo no rizosférico, sin embargo la diversidad en especies es más pobre debido a la fuerte presión selectiva impuesta por la planta (Marilley and Aragno, 1999, Appl. Soil Ecol. 13: 127-136). Con anterioridad al inicio de este trabajo se llevó a cabo un análisis transcriptómico con P. putida KT2440 en la rizosfera de maíz. En ese análisis se identificó el locus PP2560 por su inducción preferencial en este hábitat (Matilla et al., 2007, Genome Biol. 8:R179). Este locus es el primero de un clúster de tres genes que codifican un sistema de secreción de tipo 1 (T1SS). Adyacente y de transcripción divergente se encuentra el locus PP2561, que codifica una proteína de 374 kDa y fue anotada inicialmente como una bacteriocina (Nelson et al., Environ Microbiol. 2002, 4:799-808). Esta proteína presenta dos dominios imperfectos de hemo peroxidasa animal (ANHEMP-like) interrumpidos por múltiples inserciones cortas de secuencias conservadas. El extremo C-terminal de esta peroxidasa putativa presenta un motivo RTX, rico en sitios de unión a Ca de tipo hemolisina importantes para su secreción a través de un T1SS. Solo un par de proteínas procariotas con el mismo tipo de dominios aunque pertenecientes a bacterias bastante distantes filogenéticamente se habían caracterizado parcialmente y su funcionalidad estaba relacionada con la oxidación de manganeso II (Anderson et al., 2009, App. Environ. Microbiol. 75: 4130) La resistencia a estrés oxidativo es una ventaja selectiva en la rizosfera. Dado que la proteína que codifica el locus PP2561 es probablemente una peroxidasa y que los sistemas de detoxificación se consideran la primera línea de defensa contra las especies reactivas de oxígeno, la caracterización bioquímica, genética y funcional de esta proteína presentaba un interés tanto básico como aplicado. Como primer objetivo de este trabajo se planteó averiguar si la proteína presentaba actividad peroxidasa a pesar de las interrupciones que presentaban sus dominios ANHEMP-like. Estos dominios han sido más ampliamente caracterizados en mamíferos, pero en bacterias apenas han sido estudiados. La purificación de ambos dominios recombinantes y la determinación de su actividad enzimática ha permitido evidenciar que ambos presentan actividad peroxidasa dependiente de su cofactor hemo por lo que se designó a la proteína codificada por el locus PP2561 como PehA (Pseudomonas extracelular heme peroxidase). Este estudio ha permitido, por primera vez, asociar datos cinéticos a una hemo peroxidasa bacteriana perteneciente a la superfamilia de hemo peroxidasas animal. En segundo lugar, se ha llevado a cabo el estudio de las inserciones de secuencia conservada que fueron identificadas dentro de los dominios ANHEMP-like de PehA. Estas inserciones también se identificaron interrumpiendo los dominios ANHEMP-like de otras proteínas bacterianas ortólogas. Siguiendo una aproximación bioinformática, estructural y bioquímica se ha llegado a establecer que estos insertos representan un nuevo motivo de unión a calcio que hemos denominado PERCAL (de peroxidase calcium binding motif). Mediante experimentos de calorimetría isotérmica de titulación (ITC) hemos puesto de manifiesto que este motivo une específicamente iones de calcio con afinidad micromolar y un rastreo de las secuencias en las bases de datos reveló que este motivo estaba presente tanto en procariotas como en eucariotas. Como tercer objetivo se planteó investigar las condiciones en que se expresa la proteína PehA y determinar su localización celular. Los bajos niveles de expresión observados en condiciones de laboratorio imposibilitaron la detección de PehA en la cepa silvestre. Sin embargo, la localización extracelular con anticuerpos específicos se confirmó cuando se sobreexpresó pehA. Hemos designado el clúster de tres genes que encabeza el locus PP2560 como pehBCD y muy probablemente codifica el T1SS por el que se secreta PehA. El promotor de pehB resultó ser inducible por exudados radiculares y es dependiente del factor de transcripción alternativo de fase estacionaria RpoS. Tanto pehA como pehB se inducen por estrés oxidativo, especialmente a concentraciones de peróxido de hidrógeno en el rango µM, al igual que sucede con otros genes que codifican enzimas de eliminación de peróxidos. También se observó inducción de los genes peh cuando se incrementaron los niveles del segundo mensajero c-di-GMP, lo que se correlacionó con la exposición en la superficie celular. Como este segundo mensajero es responsable de la transición entre los estilos de vida planctónico y sésil, esto sugiere una resistencia a estrés oxidativo superior en las bacterias adheridas a superficies en comparación con las de vida libre. Finalmente y con la intención de desvelar el papel fisiológico y profundizar en el papel de PehA en la interacción con plantas se generó un mutante pehA nulo. A diferencia de lo observado previamente con el mutante KTRPP2561 generado por transposición (Matilla et al., 2010, Environ. Microbiol. Rep. 2:381¿388), un mutante nulo pehA presentó una competencia en colonización similar a la de cepa silvestre. Estas diferencias en el fenotipo de ambos mutantes sugerían que la producción de una versión truncada de PehA en el mutante por transposición fuera la responsable del fenotipo mutante más que la propia inactivación del locus PP2561. Sin embargo la sobreexpresión de pehA tuvo un efecto muy positivo sobre la eficiencia colonizadora de P. putida en la rizosfera, y especialmente en el ápice, una región de la raíz donde la producción de especies reactivas de oxígeno es mayor (Liszkay et al., 2004, Plant Physiol. 136:3114-3123). La sobreexpresión de pehA también redujo el número de células muertas en fase estacionaria en cultivos de P. putida e incrementó la resistencia a estrés oxidativo tanto en las cepas mutantes cono en la silvestre en el rango de concentración µM, lo que sugiere que PehA es un enzima que neutraliza las especies reactivas de oxígeno a concentraciones relevantes desde el punto de vista fisiológico. El hecho de que los dominios PehA-Nter y PehA-Cter requirieran de su cofactor hemo unido para favorecer ¿in vitro¿ la colonización del ápice por P. putida indica que el efecto positivo de PehA sobre la colonización estuvo mediado por su actividad peroxidasa. Finalmente hemos puesto de manifiesto la capacidad de P. putida KT2440 para proteger las plantas de arroz de la infección por el hongo fitopatógeno Magnaporthe oryzae mediante el desencadenamiento de resistencia sistémica y del efecto positivo que un incremento en la dosis de pehA presentó sobre esta propiedad. Los resultados obtenidos en esta tesis indican que PehA es una proteína extracelular que presenta actividad peroxidasa y que media la resistencia a estrés oxidativo en P. putida. Basándonos en los resultados, proponemos que esta proteína incrementa la capacidad de P. putida para hacer frente a la gran cantidad de especies reactivas de oxigeno que se producen en la fase estacionaria de crecimiento y como consecuencia de la interacción planta-bacteria en la rizosfera facilitando así su supervivencia y la colonización de este hábitat. Los resultados obtenidos también han permitido ampliar el espectro de plantas y patógenos sobre los que P. putida KT2440 puede ejercer propiedades de biocontrol. A un nivel más básico esta tesis ha permitido describir un nuevo motivo de unión a calcio presente tanto en procariotas como en eucariotas.