Desarrollo de nuevas estrategias para la caracterización e identificación de compuestos bioactivos en fuentes vegetales
- Morales Soto, Aránzazu
- Alberto Fernández Gutiérrez Director
- Cristina Roldán Segura Director
- Antonio Segura Carretero Director
Defence university: Universidad de Granada
Fecha de defensa: 18 July 2014
- Pilar Aranda Ramírez Chair
- Isaac Manuel Álvarez Ruiz Secretary
- Maria José Oruña Concha Committee member
- José Antonio Gabaldón Hernández Committee member
- Amadeo Rodríguez Fernández-Alba Committee member
Type: Thesis
Abstract
RESUMEN: Este trabajo reúne los resultados obtenidos durante la realización de la tesis doctoral titulada "Desarrollo de nuevas estrategias para la caracterización e identificación de compuestos bioactivos en fuentes vegetales". En ella, se analiza una gran variedad de especies vegetales como frutas, hortalizas y otras plantas, como potenciales fuentes de compuestos bioactivos. También se estudia la información obtenida con espectrometría de masas mediante el desarrollo de nuevas herramientas de tratamiento de datos y su aplicación en la caracterización e identificación de compuestos bioactivos. La memoria se presenta dividida en tres secciones: introducción, metodología y resultados con su discusión. En la Introducción, se resumen las etapas del procedimiento analítico, haciendo hincapié en los compuestos, propiedades bioactivas y técnicas analíticas de mayor relevancia para la presente tesis. En primer lugar, se dedica un apartado a la búsqueda de posibles fuentes de compuestos bioactivos, que puedan ser interesantes en cuanto a su riqueza en composición y bioactividad. A continuación, se presentan los compuestos bioactivos divididos en dos familias, terpenos y compuestos fenólicos. Se incluye un apartado de bioactividad en el que se detallan las actividades biológicas antioxidante, antimicrobiana y anticancerígena. En cada caso, se describe el fundamento en que se basan los ensayos de valoración de la bioactividad. Posteriormente, se describen los métodos de extracción de compuestos bioactivos que pueden llevarse a cabo en función de la naturaleza de la muestra y el tipo de compuesto. Siguiendo el orden del procedimiento analítico, se describe el fundamento de las técnicas separativas utilizadas, cromatografía de gases y cromatografía líquida, así como el fundamento del sistema de detección empleado, la espectrometría de masas. Finalmente, se describe la sistemática seguida convencionalmente para procesar los datos de espectrometría de masas, exponiendo las limitaciones de la misma y la consiguiente necesidad de desarrollar nuevas herramientas más versátiles para el tratamiento y procesamiento de dichos datos. En la sección de Metodología, se describe el procedimiento metodológico seguido durante la tesis. Este procedimiento general se divide en tantos apartados como etapas se llevan a cabo: (A) selección de fuentes vegetales, (B) extracción de los compuestos de interés, (C) análisis de la composición de las muestras seleccionadas, (D) evaluación de la bioactividad de las mismas, (E) tratamiento de los datos analíticos obtenidos y, por último, (F) correlación entre los datos analíticos tratados y los datos de bioactividad. De este modo, se relata la diversidad de muestras estudiadas, de métodos de extracción utilizados, de técnicas analíticas y ensayos de bioactividad empleados, así como se describen los reactivos y otros materiales utilizados durante el desarrollo experimental de la tesis. Especial mención se da a los apartados E y F, que incluyen una descripción detallada de las herramientas de tratamiento de datos de espectrometría de masas desarrolladas en la presente tesis. El tratamiento propuesto de los datos se denomina clustering y va precedido de una etapa de preprocesamiento que incluye eliminación de ruido. La aplicación del clustering permite la obtención automática de una lista de posibles compuestos, de gran ayuda para la caracterización. La estrategia de identificación de compuestos bioactivos desarrollada en esta tesis se basa en la correlación entre los datos de espectrometría de masas y los datos de bioactividad de un amplio conjunto de muestras. En cada uno de los apartados de la metodología (A - F) se recogen las diferentes especificaciones derivadas de la aplicación de la metodología general a cada estudio realizado, es decir, un primer estudio sobre vegetales y capacidad antioxidante, un segundo estudio sobre Cistus y capacidad antimicrobiana y, por último, un tercer estudio sobre aceite de oliva y actividad anticancerígena. La sección de Resultados y Discusión aparece dividida en tres bloques, donde se presentan los resultados de los estudios realizados. En el bloque 1, se valoró en primer lugar la capacidad antioxidante de una amplia colección de frutas y vegetales del sur de España (principalmente, Andalucía), incluyendo diferentes variedades de las siguientes especies vegetales: aguacate, caqui, chirimoya, granada, limón, mango, melón, membrillo, níspero, sandía, uva, ajo, alcachofa, berenjena, calabacín, cebolla, espárrago, haba, judía verde, lechuga, patata, pimiento, tomate y zanahoria. Para valorar la capacidad antioxidante, se utilizaron tres métodos diferentes: el TEAC (trolox equivalent antioxidant capacity), el FRAP (ferric ion reducing antioxidant power) y el ORAC (oxygen radical absorbance capacity). Este trabajo ofrece un estudio comparativo de la capacidad antioxidante de las variedades estudiadas a lo largo del año, dado que fueron recolectadas a diferentes tiempos. Se ha de destacar principalmente el gran número de muestras implicado en el estudio. En segundo lugar, y en base a los resultados de capacidad antioxidante, se seleccionaron tres variedades de pimiento (Capsicum annuum L.) de alta capacidad antioxidante para un estudio de caracterización. Los extractos polifenólicos de pimiento se analizaron mediante cromatografía líquida de alta resolución acoplada a un sistema de detección de batería de diodos y a espectrometría de masas con analizador de tiempo de vuelo, mediante interfase electrospray (HPLC-DAD-ESI-TOF-MS). El procesamiento convencional de los datos, basado en los perfiles cromatográficos, permitió la identificación de 45 compuestos pertenecientes a diferentes tipos de metabolitos, de los cuales, 34 se describen por primera vez en esta matriz alimentaria. Los resultados sitúan al fruto del pimiento como una fuente potencial de compuestos fenólicos. Por último en este primer bloque, se evaluaron las nuevas herramientas de tratamiento y procesamiento de datos de espectrometría de masas mediante la aplicación de las mismas con los datos analíticos y de bioactividad de las muestras de pimiento. La caracterización realizada a partir de los datos tratados con el clustering demostró la capacidad de dicha herramienta para detectar de una manera rápida y automática una gran cantidad de compuestos, entre los que se encuentran los 45 compuestos identificados mediante la caracterización convencional. Se aplicó una variante de la herramienta de correlación a este estudio de pocas muestras, con la que se obtuvieron candidatos a ser responsables de la capacidad antioxidante. En el bloque 2, se estudió tanto la fracción volátil como la fracción fenólica de especies españolas del género Cistus. Para la caracterización de los compuestos volátiles, se analizaron, mediante cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS), los compuestos volátiles previamente extraídos por microextracción en fase sólida del espacio en cabeza de las muestras (HS-SPME). Se identificaron 111 compuestos volátiles, la gran mayoría de naturaleza terpénica y de los cuales, 28 son descritos por primera vez en Cistus. Este estudio se llevó a cabo durante la estancia en el Departamento de Ciencias de la Nutrición y la Alimentación (Departament of Food & Nutritional Sciences) de la Universidad de Reading, Reino Unido. El estudio de la fracción fenólica incluyó tanto la caracterización como la valoración de la capacidad antimicrobiana de extractos derivados de las especies de Cistus. Los extractos obtenidos por diferentes métodos de extracción y secado se analizaron mediante cromatografía líquida de alta resolución acoplada a espectrometría de masas con analizador de tiempo de vuelo mediante sistema de ionización por electrospray (HPLC-ESI-TOF-MS). Se realizó la caracterización por el método convencional, lográndose identificar un total de 58 compuestos, de los cuales 18 se describen por primera vez en Cistus. Para evaluar la capacidad antimicrobiana de los extractos polifenólicos de Cistus, se utilizaron dos modelos bacterianos, Escherichia coli como modelo de bacteria Gram negativa y Staphylococcus aureus como modelo de Gram positiva. Los resultados mostraron que la actividad biológica no sólo dependió del quimiotipo de la especie utilizada, sino que también influyeron los procedimientos de extracción y secado utilizados. El estudio de la capacidad antimicrobiana se realizó en colaboración con el Instituto de Biología Molecular y Celular de la Universidad Miguel Hernández de Elche (Alicante, España). Por último en este segundo bloque, se evaluaron las herramientas de clustering y correlación mediante su aplicación con los datos analíticos y de bioactividad de los extractos polifenólicos de Cistus. Se seleccionaron tres extractos de Cistus de alta bioactividad y se analizaron mediante cromatografía líquida de ultra alta resolución acoplada a espectrometría de masas con analizador de masas de cuadrupolo-tiempo de vuelo mediante una interfase electrospray (UPLC-ESI-QTOF-MS). Los datos procedentes de este análisis se trataron mediante el clustering, poniendo de manifiesto, por un lado, la información estructural proporcionada por el QTOF y, por otro, la utilidad del clustering en la caracterización pormenorizada de extractos. El tratamiento de los datos permitió la detección de picos que por coelución, se habían obviado en la caracterización convencional anterior. Para el estudio de correlación, se utilizó una colección de 26 extractos polifenólicos de Cistus y sus correspondientes datos de capacidad antimicrobiana, correlacionando de manera separada los resultados realizados con los diferentes modelos de bacteria. En ambos casos, se obtuvieron candidatos a ser responsables de la bioactividad, destacando principalmente los elagitaninos frente a bacterias Gram negativas y los flavonoides frente a bacterias Gram positivas. En el bloque 3, se utilizaron los datos analíticos procedentes de una amplia colección de extractos polifenólicos de aceite de oliva virgen extra. Primeramente, se realizó la caracterización de los extractos a partir de los datos tratados con el clustering. De esta forma, se demostró que se obtienen los compuestos identificados en estudios de caracterización anteriores, realizados con el método convencional. En segundo lugar, se realizó el estudio de correlación con la bioactividad. Para ello, se valoró la actividad anticancerígena de los extractos polifenólicos de aceite frente a la línea celular de cáncer de mama JIMT-1, en colaboración con el Instituto Catalán de Oncología de Girona. La correlación con la bioactividad se realizó partiendo de los datos tratados mediante dos tipos de clustering. En ambos casos, los candidatos obtenidos como compuestos responsables de la actividad anticancerígena observada fueron tres isómeros de la oleuropeína aglicona. La similitud en los resultados obtenidos con ambos métodos de clustering pone de manifiesto la utilidad de la herramienta de correlación, a la vez que se demuestra la rapidez y robustez del clustering. Todo ello permitió verificar la potencialidad de la herramienta de correlación propuesta como estrategia para la identificación de compuestos candidatos a ser responsables de la bioactividad, así como también la potencialidad predictiva de la misma. SUMMARY: This work summarizes all the results presented in the PhD thesis entitled "Desarrollo de nuevas estrategias para la caracterización e identificación de compuestos bioactivos en fuentes vegetales (Development of new strategies for the characterization and identification of bioactive compounds in plant sources)". In this thesis, a wide variety of vegetal species such as fruits, vegetables and other plants are assessed as potential sources of bioactive compounds. The potential offered by mass spectrometry data is also studied in this work, through the development of new data processing tools and their application to the characterization and identification of bioactive compounds. The current report is divided into three main sections: Introduction, Methodology and Results and Discussion. The Introduction deals with the stages of the analytical procedure of a sample, highlighting the most relevant compounds, bioactive properties and analytical techniques used in this thesis. A subsection is included on the search for potential sources of bioactive compounds. Subsequently, terpenes and phenolic compounds are described in the context of their role as bioactive compounds. A subection about the biological activity of these compounds is provided next, focused on their antioxidant, anticancer, and antimicrobial activities. For every case, the fundamentals of the bioactivity assays are described. Subsequently, the different extraction systems that can be used for bioactive compounds are itemized, depending on the compounds and the nature of the sample. Continuing with the stages of the analytical procedure, gas chromatography and liquid chromatography separation techniques are described, as well as the mass spectrometry detection system used in this work. Finally, the method carried out to process the mass spectrometry data is described. Certain drawbacks of this conventional method imply the need to develop new and versatile methods for processing mass spectrometry data. The Methodology section describes the methodological procedure followed in the thesis. This general procedure is divided into as many subsections as multiple steps were performed: (A) selection of plant sources, (B) extraction of the compounds of interest, (C) analysis of the composition of the selected samples, (D) bioactivity assessments, (E) analytical data processing and, finally, (F) the correlation between the processed analytical data and the bioactivity data. In this way, a wide variety of samples, extraction methods, bioactivity assays and analytical techniques are described, as well as the reagents and other materials employed in the present work. Special mention is given to subsections E and F, including a detailed description of the new mass spectrometry data processing tools developed in this PhD thesis. The proposed tool for data treatment is called clustering and is preceded by a pre-processing stage incorporating noise removal. The application of clustering automatically provides a list of possible compounds, which is very useful for characterization. The strategy for identifying bioactive compounds developed in this thesis is based on the correlation between the mass spectrometry data and the bioactivity data from a large set of samples. The subsections of the Methodology section (A - F) include the different specifications from the application of the general methodology to the studies performed: an initial study on vegetables and antioxidant capacity, a second study on Cistus and antimicrobial capacity and, finally, a third study on olive oil and anticancer activity. The Results and Discussion section is composed of three subsections, corresponding to the studies carried out. In Subsection 1, the antioxidant capacity of a large collection of fruit and vegetable samples grown in southern Spain (mainly Andalusia) was evaluated. The samples included different cultivars of their species, collected at different times of the year: asparagus, artichoke, carrot, eggplant, fava bean, garlic, green bean, lettuce, onion, pepper, potato, tomato, zucchini, avocado, custard apple, grape, lemon, loquat, mango, melon, persimmon, pomegranate, quince and watermelon. Three different methods were used for assessing the antioxidant capacity: TEAC (trolox equivalent antioxidant capacity), FRAP (ferric ion reducing antioxidant power) and ORAC (oxygen radical absorbance capacity). This work offers a comparative study on the antioxidant capacity provided by the intake of these Spanish fruits and vegetables year round. The huge number of samples involved in this study must be highlighted. Secondly, three cultivars of pepper (Capsicum annuum L.) showing high antioxidant capacity values were selected for a characterization study of their polar fraction. The polyphenolic pepper extracts were analyzed by using high performance liquid chromatography coupled to diode-array and time-of-flight mass spectrometry (HPLC-DAD-ESI-TOF-MS). Conventional data processing, based on chromatographic profiles, allowed the identification of 45 compounds belonging to different metabolite classes, 34 of which were described for the first time in pepper. The results showed that pepper is a good source of phenolic compounds, and this information could be used in order to update Spanish food composition tables. Finally in this subsection, new data processing tools were evaluated by applying them to the analytical and bioactivity data of the pepper samples. Characterization through clustering enabled us to detect in a quick and automatic manner a large number of compounds, among which the 45 compounds identified by the conventional characterization were found. For this study including only a few samples, the correlation tool was used with some variation, and candidates responsible for the antioxidant capacity were obtained. In Subsection 2, both the volatile and phenolic fractions of Spanish species of the Cistus genus were studied. For the characterization of the volatile fraction, gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS) was used to analyze the volatile compounds extracted by using headspace solid-phase microextraction (HS-SPME). This analysis enabled the identification of 111 volatile compounds (mainly terpenes), 28 of which were reported for the first time in Cistus. This study was carried out during the stay in the Department of Nutrition and Food Sciences at Reading University (United Kingdom). The study of the phenolic fraction included both the characterization and the evaluation of the antimicrobial activity of the extracts from different Cistus species. Different extraction and drying systems were used to obtain the extracts, which were analyzed by using high performance liquid chromatography coupled to time-of-flight mass spectrometry (HPLC-ESI-TOF-MS). By the conventional characterization of these extracts, a total of 58 compounds were tentatively identified, 18 of which were reported for the first time in Cistus. In order to assess the antimicrobial capacity of the polyphenolic Cistus extracts, two bacteria models were employed, i.e. Escherichia coli and Staphylococcus aureus as Gram negative and Gram positive bacteria models, respectively. The results showed that the biological activity not only depended on the chemotype of the species used, but also on the extraction and drying techniques used. This work was conducted in collaboration with the Institute of Molecular and Cellular Biology at Miguel Hernández University (Elche, Alicante, Spain). Finally in this subsection, the new data processing tools were evaluated by applying them to the analytical and bioactivity data of the Cistus polyphenolic extracts. Three Cistus extracts showing high bioactivity were selected and analyzed using ultra high performance liquid chromatography coupled to quadrupole-time-of-flight mass spectrometry (UPLC-ESI-QTOF-MS). The data from these analyses were processed by the clustering tool, demonstrating the structural information provided by the QTOF mass analyzer and the usefulness of clustering for the comprehensive characterization of extracts. The application of clustering allowed the detection of peaks that were ignored in the conventional characterization due to coelution. For the correlation study, the analytical data from a collection of twenty-six polyphenolic Cistus extracts and their antimicrobial capacity data were correlated; that was performed separately for the different bacteria models. In both cases, candidates for bioactive compounds were obtained, highlighting ellagitannins against Gram negative bacteria and flavonoids against Gram positive bacteria. In Subection 3, the analytical data from a collection of polyphenolic extracts of extra-virgin olive oil were used. First, a characterization of the extracts was performed using the clustering processing tool. It was found that all compounds previously identified by the conventional procedure were obtained with this new tool. Next, the correlation study with the bioactivity data was implemented. For this purpose, the anticarcinogenic activity of the extracts against the JIMT-1 breast cancer cell line was evaluated in vitro. The study investigating anticancer activity was developed in collaboration with the Catalan Institute of Oncology in Girona. The correlation study was performed using the analytical data from two different clustering tools. In both cases, the candidates obtained as compounds responsible for the anticancer activity were three isomers of oleuropein aglycone. The similarity of the results obtained with both clustering tools showed the usefulness of the correlation tool, while the speed and robustness of clustering was demonstrated. This confirmed the potential of the correlation tool as a strategy for identifying bioactive candidates as well as the predictive potential of this method.