Expresión de mgmt y mmr en células tumorales de glioblastoma como indicadores de la respuesta al tratamiento con temozolamida

Resumen

El glioblastoma multiforme (GBM) representa el glioma más agresivo en la población adulta y es una enfermedad con una progresión rápida y una mediana de supervivencia global inferior a un año. La cirugía es el tratamiento inicial y permite obtener un diagnóstico histológico, aumentar la eficacia de la quimiorradioterapia posterior y aumentar la supervivencia. En los últimos años la radioterapia con temozolamida concurrente seguida de temozolamida adyuvante se ha convertido en el tratamiento estándar de estos pacientes. Sin embargo, a pesar de los avances en las resecciones quirúrgicas y en el tratamiento quimioterápico y radioterápico la respuesta al tratamiento, la supervivencia de estos pacientes sigue siendo escasa. Las investigaciones más recientes se centran en la existencia de de mecanismos de resistencia frente al tratamiento de elección de estos pacientes que es la temozolamida. El mecanismo de resistencia más estudiado en este tipo de tumores es la proteína reparadora metil-guanina-O6-DNA metiltransferasa (MGMT). Existen muchos estudios en los que la determinación de la metilación del promotor del gen de la proteína MGMT se utiliza como factor pronóstico de supervivencia y respuesta al tratamiento con temozolamida, siendo aceptado por la comunidad científica. Esta proteína de reparación, repara el ADN a través de la eliminación directa de un grupo alquilo del átomo O6 de la guanina en el ADN de las células expuestas a agentes alquilantes, como es la temozolamida. La regulación de la expresión de esta proteína se basa en un silenciamiento epigenético mediante metilación del promotor. Cuando el promotor del gen de MGMT se encuentra metilado, el gen se encuentra silenciado y por lo tanto no se produce proteína reparadora. En este caso la lesión que produce el agente alquilante en la célula tumoral mediante quimioterapia se convierte en irreversible y la célula entra en apoptosis. Esto implica que pacientes que presentan el gen MGMT metilado tengan un mejor pronóstico frente al tratamiento con temozolamida tal y como demuestran diversos estudios como los de Stupp y cols., (2009) en los que se incrementa la supervivencia global de los pacientes con MGMT metilado de 12,2 meses a 18,2 meses. Por el contrario, existen estudios que ponen de manifiesto la existencia de pacientes que a pesar de tener MGMT metilado no presentan mejoras en la supervivencia tras el tratamiento con temozolamida. Por esta razón en los últimos años y cada vez más se están proponiendo otros mecanismos de resistencia a la TMZ como son el complejo de reparación de errores en el DNA, MMR, y la proteína de resistencia a multidrogas P-glicoproteína. El sistema de reparación de errores MMR funciona introduciendo mellas en el DNA cuando reconoce un apareamiento erróneo de bases mediante un ciclo fútil de reparación. Esto provoca una señal para el inicio de la apoptosis celular. Cuando este complejo esta mutado y por lo tanto no es funcional o cuando existe una disminución de la expresión del mismo, hace que la célula sea más resistente al tratamiento con TMZ ya que no se produce la apoptosis celular. Los estudios de Cahill y cols., (2007) y Flesberg y cols., (2011) determinan que la disminución de la expresión de MMR o la delección de una de sus subunidades, en este caso la MSH6, está presente en glioblastomas recurrentes pudiendo ser la causa de progresión tumoral observada en estos pacientes. La P-glicoproteína es una proteína transportadora de la membrana citoplasmática, que se conoce con el nombre de MDR-1 (MultiDrug Resistance 1). Esta proteína ha sido muy estudiada en cáncer de colon y mama, y se ha visto que es responsable de la resistencia a los fármacos de elección en estos tipos tumorales, ya que es capaz de expulsar el fármaco fuera de la célula en un proceso dependiente de energía y mediado por ATP, evitando su actuación. En el caso de tumores gliales se conoce la presencia de la P-glicoproteína en la cara luminar de la barrera hematoencefálica, actuando como protector de cualquier sustancia tóxica o nociva para el sistema. Por ello, en este trabajo de investigación nos hemos centrado también en el análisis de p-glicoproteína como mecanismo de resistencia en tumores gliales. Para el desarrollo de esta tesis doctoral comenzamos realizando un estudio sobre muestras de 52 pacientes del Hospital Virgen de las Nieves de Granada procedentes de biopsias intraoperatorias, con el objeto de confirmar el valor del marcador pronóstico MGMT como factor predictivo de supervivencia y repuesta al tratamiento con Temozolamida. Los resultados de este estudio nos han permitido completar y validar los resultados previamente publicados en J. Trans. Med. (Melguizo y cols., 2012) mostrando que de los 52 pacientes estudiados, un 53,8% presentaba metilación del promotor de MGMT frente a un 44,2% sin metilación. La correlación del estado de metilación con el historial clínico de los pacientes, concretamente con la tasa de supervivencia, nos ha permitido determinar que existe una correlación positiva entre el estado de metilación de MGMT y la supervivencia de estos pacientes, que incrementa en un 15% en los pacientes que presentan metilación en MGMT. A pesar de la correlación positiva encontrada entre supervivencia y metilación del promotor de MGMT, en múltiples trabajos no ha sido posible explicar la no respuesta al tratamiento con temozolamida en pacientes que presentan metilación de MGMT, por ello hemos realizado un estudio in vitro en distintas líneas celulares de tumores de sistema nervioso de para determinar la implicación de otros mecanismos de resistencia a la temozolamida. El estudio in vitro en líneas celulares de glioblastoma (SK-N-SH, SF268, LN229 y A172) sometidas a la acción de la temozolamida nos ha permitido diferenciar entre dos tipos de compartamiento frente a este fármaco, líneas que presentan una elevada expresión basal de MGMT (SK-N-SH, SF268) y una elevada resistencia a temozolamida y, líneas que al no expresar MGMT (LN229 y A172) son relativamente sensibles a la acción de temozolamida. El análisis de la modulación de la expresión de diferentes mecanismos de reparación del ADN, MGMT y MMR, tras la exposición de los dos tipos de líneas celulares a temozolamida ha demostrado que aquellas líneas celulares que tienen una alta expresión basal de MGMT apenas presentan expresión de los genes estudiados del complejo MMR y que aquellas líneas con baja expresión de MGMT basal presentan una alta expresión de los genes del MMR. Tras la exposción a temozolamida en las líneas con baja expresión basal de MGMT (A172 y LN229) encontramos un incremento en el nivel de expresión de MGMT y una disminución del complejo de reparación MMR, lo que indicaría la contribución de ambos mecanismos en el incremento de resistencia a temozolamida de estas líneas observado por el incremento del valor de IC50 para este fármaco. En el caso de las líneas con alta expresión basal de MGMT (SF268 y SK-N-SH), la expresión del ARNm de MGMT disminuye tras la administración de los ciclos con temozolamida, lo que teóricamente provocaría una disminución de la resistencia al fármaco, de igual forma, la expresión del complejo MMR provocando un aumento de la resistencia al fármaco, pudiendo ambos mecanismos compensarse no modificando los valores de IC50 en estas líneas. La variación de la expresión de la proteína MGMT mediante el uso de agentes desmetilantes, como la 5-Aza-2¿-deoxicitidina, o compuestos que bloqueen su acción, como la O6-benzilguanina, nos permitió demostrar que el incremento del MGMT en células que presentan un sistema MMR activo, provoca un aumento de la resistencia, mientras que en células con sistemas MMR deficientes, las modificaciones tanto la inhibición como la sobre expresión, no afectan a la sensibilidad al fármaco. El estudio de mecanismos clásicos de resistencia a multidrogas mediado por transportadores, como MDR nos ha permitido comprobar que los bajos niveles basales de p-gliocoproteína en las líneas celulares y su incremento tras la exposición de los cultivos celulares a temozolamida son insuficientes para influir en la resistencia de estas líneas puesto que su bloqueo con verapamilo no implica modificación en la dosis inhibitoria 50 frente a la temozolamida. Finalmente en análisis de la expresión de un marcador de células madre tumorales de sistema nervioso como es el CD133, que incrementa tras la exposición a temozolamida de los cultivos celulares, puede ser el responsable de conferir resistencia a las células y por tanto de los fenómenos de recidivas en pacientes.