Reconocimiento de secuencias ricas en prolina por dominios modulares de interacción proteína-proteína

Resumen

El origen de la palabra proteína parece provenir del griego "prota", que significa lo primero, o del dios "proteo" por la cantidad de formas diferentes que puede tomar. Las proteínas, o mejor dicho los aminoácidos que las componen, son uno de los elementos básicos e imprescindibles que conforman las células, junto con el ADN, ARN, glúcidos y lípidos. La mayoría de procesos biológicos celulares dependen de las proteínas, que tienen funciones muy diversas: son elementos estructurales que ayudan a mantener la integridad de las células, conectan diferentes elementos dentro de ellas, son responsables de la regulación y transporte de nutrientes, generan, transforman y transfieren impulsos nerviosos, amén de otras muchas más funciones (Pawson 1995). Dentro del contexto funcional, las proteínas establecen una compleja red de interacciones que es crucial para el correcto funcionamiento celular. Cualquier distorsión de esta red de interacciones puede traducirse en serias alteraciones de las funciones celulares que originan el desarrollo de muchas enfermedades humanas, algunas del calibre del cáncer o VIH. Por este motivo, una profunda y detallada comprensión de estas interacciones nos permitirá predecir y modular la respuesta fisiológica, o incluso patológica, de la célula a un estímulo específico y facilitará el desarrollo de nuevas estrategias de diseño molecular que puedan ser utilizadas en el tratamiento de algunas de estas enfermedades. Con la revolución en el campo de la genómica y proteómica experimentada durante la última década se ha hecho aún más patente la necesidad de profundizar en el estudio del reconocimiento molecular por parte de numerosas proteínas. La resolución del genoma humano, junto con la de otros organismos modelo, ha proporcionado miles de nuevos genes y proteínas que deberán caracterizarse estructural y funcionalmente. Sus interacciones con otras moléculas en la célula deberán ser identificadas y analizadas con el fin de avanzar hacia la comprensión y el control de los mecanismos de regulación celular. A su vez, muchas de las proteínas identificadas en los genomas son dianas potenciales para el desarrollo de nuevos agentes terapéuticos contra una gran variedad de enfermedades que habrá que validar y caracterizar. Las interacciones proteína-proteína se establecen frecuentemente a través de pequeños dominios modulares que se encuentran muy conservados y están presentes en distintas proteínas, los cuales reconocen secuencias específicas en sus dianas (Pawson 1995; Pawson et al. 2002; Pawson 2004). Dentro de los diferentes tipos de dominios modulares, uno de los más ampliamente representados en el genoma humano son los que reconocen secuencias ricas en prolina (MRP) (Zarrinpar & Lim 2000; Mayer 2001; Macias et al. 2002; Zarrinpar et al. 2003a). Actualmente se conocen hasta cinco familias de este tipo de dominios, que son los dominios SH3, WW, EVH1, GYF y UEV (Ball et al. 2005). Bastantes de los miembros de estas familias están implicados en el desarrollo de enfermedades como la leucemia humana, alzheimer, ébola y VIH, entre otras, por lo que el diseño de ligandos que interfieran en el establecimiento de las interacciones con sus dianas se ha consolidado en los últimos años como una estrategia viable para el desarrollo de nuevos fármacos específicos contra estas enfermedades (Kardinal et al. 2000; Lee et al. 2002; Oneyama et al. 2002). En todos los casos, estos dominios modulares reconocen secuencias consenso específicas, caracterizadas por contener al menos un resto prolina, que favorecería la formación de la hélice de poliprolina II (PPII) necesaria para la unión al dominio (Sudol 1998; Macias et al. 2002). A pesar de las grandes diferencias estructurales entre las distintas familias y la diversidad en las secuencias que reconocen, todas las familias comparten un mecanismo común para el reconocimiento de sus ligandos muy similar al establecido en la última década para los dominios SH3, que se basa en la inserción de las prolinas principales del ligando en bolsillos hidrofóbicos del dominio formados por restos aromáticos (Ball et al. 2005; Li 2005). Aunque los dominios SH3 son los más ampliamente estudiados, los determinantes de la afinidad y especificidad de unión de las interacciones que establecen siguen sin estar lo suficientemente claros hoy día, debido en gran medida a la escasa información disponible sobre la naturaleza y magnitud de las fuerzas que dirigen estas interacciones. Así, mientras que para los dominios SH3 existen algunos trabajos que muestran un patrón termodinámico incongruente con la naturaleza hidrofóbica del sitio de unión y de los ligandos, para otras familias de MRP no existe ningún trabajo de este tipo. El objetivo que se pretende con este trabajo es llevar a cabo una caracterización detallada de las interacciones establecidas por los dominios SH3, así como de otras dos familias de dominios modulares, WW y UEV, para las que apenas existe información de carácter biofísico. Para ello, hemos abordado el estudio de estas interacciones haciendo uso de diversas técnicas experimentales, desde la clonación, expresión y purificación de ejemplos representativos de cada una de estas familias de dominios, hasta su estudio con técnicas experimentales espectroscópicas, calorimétricas, y en algunos casos hasta su determinación estructural mediante difracción de rayos X, así como con técnicas computacionales, mediante simulaciones de dinámica molecular de algunos de sus complejos con ligandos. El trabajo realizado en esta Memoria se ha llevado a cabo en las siguientes secciones: I. Caracterización termodinámica y estructural de las interacciones establecidas por el dominio Abl-SH3 con ligandos ricos en prolina. II. Evaluación del papel de las moléculas de agua en las interacciones que establece Abl-SH3 con el ligando rico en prolina p41 mediante técnicas calorimétricas, cristalográficas y computacionales. III. Caracterización termodinámica de las interacciones establecidas por dominios WW (Yap65-WW y Nedd4-WW3) con dominios L tipo PPxY (secuencias ricas en Pro presentes en las poliproteínas gag de algunos virus como el ébola y de la leucemia humana). IV. Caracterización termodinámica y estructural de las interacciones establecidas por el dominio UEV de Tsg101 con dominios L tipo PTAP. El objetivo final que se pretendió fue, por consiguiente, obtener información energética, estructural y dinámica que sea útil para el diseño de nuevos ligandos con mejores propiedades (afinidad y especificidad) que puedan ser utilizados con fines terapéuticos en el tratamiento de algunas de estas enfermedades.