Evaluación de la toxicidad de plaguicidas mediante biomarcadores moleculares y enzimáticos

Resumen

El uso de productos fitosanitarios y fertilizantes en agricultura, especialmente en el cultivo intensivo bajo invernaderos, ha supuesto un cambio sustancial en la producción agrícola pero también ha originado problemas de salud ambiental y ocupacional debido a la exposición a estos agentes químicos. Los invernaderos se caracterizan por presentar unas condiciones ambientales excepcionales de calor, humedad y ventilación que incrementan de forma sustancial la producción agrícola. No obstante, estas condiciones también favorecen la proliferación de plagas que ponen en peligro el rendimiento de los cultivos, lo que precisa el uso de plaguicidas, en ocasiones de forma inadecuada y sin seguir las buenas prácticas agrícolas. Estas circunstancias entrañan situaciones de riesgo para los trabajadores que desempeñan su actividad laboral en el interior de invernaderos, independientemente de que sean aplicadores profesionales o no. En las últimas décadas, la provincia de Almería, especialmente su litoral, se ha convertido en uno de los lugares más importantes para el cultivo bajo plástico debido a sus características geográficas y climatológicas. Allí se concentran grandes extensiones de invernaderos que suponen la principal actividad económica. La aplicación frecuente de plaguicidas, de forma más o menos regular, puede originar efectos adversos sobre la salud de los trabajadores expuestos, especialmente en un entorno de agricultura intensiva. Así, las exposiciones crónicas a estos compuestos pueden dar lugar inicialmente alteraciones bioquímicas que no conducen necesariamente a síntomas clínicos, aunque al tratarse de respuestas biológicas medibles y objetivables pueden usarse como biomarcadores que ayudan a predecir la aparición de una enfermedad antes de que se manifieste clínicamente. Por eso tiene la consideración de toxicidad subclínica, ya que, tras un período de latencia más o menos prolongado, puede desencadenar manifestaciones propias de una intoxicación crónica. Estos trastornos van precedidos de una afectación a nivel bioquímico de los órganos diana (hígado, riñón, sistema nervioso y sistema inmunológico, entre otros) que puede evaluarse mediante el uso de biomarcadores de respuesta tóxica órgano-específica así como de biomarcadores inespecíficos de estrés oxidativo o alteraciones de enzimas que interaccionan con plaguicidas (esterasas). Esto ayudaría a establecer una relación causal entre la exposición crónica a plaguicidas y alteraciones funcionales y orgánicas subclínicas. exposición crónica; biomarcadores, esterasas; estrés oxidativo hepatotoxicidad; nefrotoxicidad; neurotoxicidad; inmunotoxicidad En el presente estudio se han evaluado trabajadores de invernadero expuestos a plaguicidas y un grupo de controles no expuestos en dos periodos diferentes de una misma campaña agrícola, uno de alta exposición (con un mayor uso de plaguicidas) y el otro de baja exposición, donde se utilizan menos estos compuestos. Se recogieron muestras biológicas en las que se determinaron biomarcadores de exposición a plaguicidas (metabolitos de diversos grupos de plaguicidas) y biomarcadores de efecto órgano-específicos (hepáticos, renales, neurológicos e inmunológicos) e inespecíficos (esterasas y estrés oxidativo). Los resultados del análisis de metabolitos de plaguicidas en orina indican que la población de estudio está expuesta principalmente a metabolitos de organofosforados –OPs– (dialquilfosfatos, DAPs) preformados en el ambiente y presentes en alimentos, sobre todo a expensas de OPs dimetilos que son la mayoría de los que están autorizados en la actualidad para su uso agrícola en la Unión Europea. Sin embargo, no hay indicios de que los trabajadores de invernadero evaluados presentaran exposición ocupacional a OPs en base a la encuesta epidemiológica administrada y a la información agronómica sobre los plaguicidas usados en los productos hortofrutícolas cultivados en los invernaderos durante el periodo de estudio. El análisis de una importante submuestra de trabajadores no arrojó resultados detectables de ácido 3-fenoxibenzoico y ácido 6-cloronicotínico, metabolitos comunes de numerosos piretroides y neonicotinoides, respectivamente, debido probablemente a la corta vida media de estos plaguicidas. Por tanto, los resultados de la biomonitorización de la población de estudio no indican exposición ocupacional a OPs, piretroides o neonicotinoides, aunque no se puede descartar por completo la exposición a otros plaguicidas o incluso a estos mismos pero que la biomonitorización no ha sido capaz de detectarlos por su baja persistencia y razones de tipo toxicocinético. En lo que respecta a las esterasas estudiadas, la acetilcolinesterasa (AChE) mostró un descenso en su actividad en los trabajadores de invernadero con respecto a los controles, especialmente en el periodo de alta exposición, que se relacionó con un incremento de estrés oxidativo inducido por plaguicidas y ulterior peroxidación lipídica de las membranas eritrocitarias. Dicho efecto no se puede atribuir a la exposición a OPs por las razones indicadas previamente. Por su parte, las colinesterasas plasmáticas mostraron niveles más altos en el periodo de alta exposición con respecto al de baja y en los expuestos frente a los controles, lo que se puede interpretar como respuesta homeostática dirigida a regular los niveles de acetilcolina para mantener así un bajo nivel de inflamación sistémica como mecanismo de defensa reactivo frente a la exposición a plaguicidas. Ambas colinesterasas (plasmática y eritrocitaria) actuarían, por tanto, de manera coordinada en la terminación de la vía antiinflamatoria colinérgica controlada por la acetilcolina. En cuanto a la paraoxonasa-1 (PON1), los trabajadores de invernadero presentaron niveles significativamente más altos de actividad hidrolítica frente al paraoxón (POasa) y de arilestersasa (AREasa) que los controles, así como en el periodo de alta exposición con respecto al de baja. Esta mayor actividad PON1 es dependiente del sustrato (pues con la lactonasa –DHCasa– se observa un descenso en lugar de un aumento) y podría atribuirse a una mayor expresión del enzima a través de diversos receptores nucleares para contrarrestar la disminución de la actividad AChE secundaria a un mayor estrés oxidativo como el inducido por plaguicidas. Así, ambas esterasas (PON1 y AChE) actuarían de forma coordinada. En relación a los biomarcadores de estrés oxidativo se observaron mayores niveles de sustancias reactivas al ácido barbitúrico (TBARS) y grupos tioles totales (SHT) en los trabajadores de invernadero con respecto a los controles en el periodo de alta exposición a plaguicidas. Sin embargo, el hallazgo más consistente fue el aumento de GGT en los trabajadores también en el periodo de alta exposición. Estos resultados parecen indicar cierto grado de estrés oxidativo asociado a la exposición a plaguicidas y que probablemente tiene su origen en el metabolismo de plaguicidas o por interferencia con los sistemas de defensa antioxidante celular. Del presente estudio se desprende que la GGT puede ser un biomarcador sensible de estrés oxidativo ante la exposición a plaguicidas. Los biomarcadores de nefrotoxicidad estudiados no sugieren afectación glomerular ya que los valores de microalbuminuria, índice de filtración glomerular (IFG), creatinina y cistatina C séricas no se asociaron con la exposición a plaguicidas. Sin embargo, sí parece observarse una ligera alteración tubular, debido a las alteraciones de osteopontina (OPN) y el factor trébol 3 (TFF3), que mostraron niveles más altos en los trabajadores expuestos que en los controles y en el periodo de alta exposición con respecto al de baja. Estos resultados reflejarían cierta afectación de la reabsorción tubular o una mayor expresión de ambas proteínas como consecuencia de un daño tubular renal atribuido a la exposición a plaguicidas. No obstante, otros biomarcadores de daño tubular (β2M, cistatina C urinaria y NGAL) no mostraron alteraciones significativas asociadas con la exposición. El comportamiento de los biomarcadores de hepatotoxicidad no es muy concluyente. Aunque se ha observado un ligero aumento de la transaminasa AST en los trabajadores de invernadero con respecto a los controles en ambos periodos de estudio, que sería indicativo de cierta afectación tóxica hepatocelular, los resultados más llamativos muestran un descenso de la fosfatasa alcalina, arginasa I y GST-α en los trabajadores expuestos con respecto a los controles, lo que habla en contra de un posible daño tóxico hepatocelular. Ese descenso podría atribuirse a un hipotético mecanismo que regule la expresión de las tres enzimas de una manera coordinada, aunque no está claro su origen. Los resultados de los biomarcadores de neurotoxicidad estudiados (pNF-H y proteína S100B) muestran ciertos indicios, no muy sólidos, de afectación neurológica asociada a la exposición a plaguicidas. Esto puede deberse a que los trabajadores de invernadero no estaban expuestos a plaguicidas intrínsecamente neurotóxicos. Es posible que esta ligera afectación, tanto neuronal como glial, pueda deberse también a una mayor permeabilidad de la barrera hematoencefálica o a cierto grado de neuroinflamación, en ambos casos secundarios a una respuesta inespecífica frente a la exposición a plaguicidas. Por último, y en relación a los biomarcadores de inmunotoxicidad estudiados, el aumento de citoquinas proinflamatorias y quimioquinas sugiere que la exposición a plaguicidas puede provocar una respuesta inflamatoria sistémica de bajo grado, estimulando la producción de mediadores de inflamación y favoreciendo la migración de células inflamatorias hacia tejidos en los que se ha desencadenado el proceso inflamatorio. Por su parte, el aumento de los factores de crecimiento hematopoyéticos induciría angiogénesis por proliferación y activación de células endoteliales en aquellos tejidos que presentan respuesta inflamatoria. Sin embargo, el alto porcentaje de valores no detectados de factores estimulantes de colonias sugiere que la inflamación que se produce es de baja intensidad y no precisa de la formación y maduración de nuevas células. Esta inflamación sistémica podría aumentar la permeabilidad de la barrera hematoencefálica y estimular las vías neuroinflamatorias, dando lugar a cierta afectación neurotóxica indirecta. The use of plant protection products products and fertilizers in intensive agriculture, especially in greenhouses, represented a substantial change in crop production but also may lead to environmental and occupational health problems as a result of exposure to those chemicals. Greenhouses are characterized by exceptional environmental conditions of warm, humidity and ventilation, which substantially increase crop production. However, these conditions contribute to the proliferation of pests that threaten crop yields, and hence the use of pesticides is required to prevent this threat, although sometimes they are inadequately used and without following good agricultural practices. These circumstances give rise to risky situations for farm workers performing their work within greenhouses, regardless of whether they are professional applicators or not. In recent decades, the province of Almeria (Spain), especially its coastline, has become one of the most important areas of intensive agriculture under plastic greenhouses because of its geographic and weather characteristics. These large areas of greenhouses represent the main economic activity of Almería. Long-term exposure to pesticides can cause adverse health effects in the exposed populations, especially in intensive farming workers. These exposures may initially induce biochemical alterations that do not necessarily result in overt clinical symptoms; in turn, they may lead to measurable and objective biological responses that can be used as biomarkers of effect that are helpful for the prediction of diseases before they manifest clinically. This represents a kind of subclinical toxicity that, after a period of latency, can trigger clinical manifestations of chronic toxicity. These disorders are preceded by biochemical dysfunction of target organs (liver, kidney, nervous system and immune system, among others), which can be evaluated by using organ-specific biomarkers of toxic response and non-specific biomarkers such as those reflecting oxidative stress or changes in enzymes interacting with pesticides (e.g., certain esterases). This would help to establish a causal relationship between chronic exposure to pesticides and functional and subclinical organ dysfunction. The present study assessed greenhouse workers exposed to pesticides, and a group of controls lacking this exposure, in two different periods of the same crop season, one of high exposure (with greater use of pesticides) and the other of low exposure, where these compounds were less used. In the collected biological samples (blood and urine), biomarkers of exposure to pesticides (metabolites of several pesticide groups) and biomarkers of target organ toxicity (liver, kidney, neurological and immunological systems) were measured together with non-specific biomarkers such as esterase activities and oxidative stress end-points. The analysis of metabolites of pesticides in urine indicated that the study population was mainly exposed to organophosphate -OPs- metabolites (dialkylphosphates, DAPs) preformed in the environment and present in food, especially at the expense of dimethyl compounds, most of which are currently authorized for their use in agriculture in the European Union. However, there was no evidence that greenhouse workers presented occupational exposure to OPs according to the epidemiological questionnaire administered to the study subjects and the agronomic information on pesticides used for the horticultural products grown in greenhouses during the study period. The analysis of an important subset of workers did not yield detectable results of 3-phenoxybenzoic acid and 6-chloronicotinic acid, common metabolites of numerous pyrethroid and neonicotinoid insecticides, respectively, probably because of the short half-life of these compounds. Therefore, the biomonitoring results of the study population failed to indicate occupational exposure to OPs, pyrethroids or neonicotinoids, although exposure to other pesticides or even to those pesticides cannot be ruled out at all. Regarding the esterases studied, acetylcholinesterase (AChE) activity was reduced in greenhouse workers relative to controls, especially in the period of high pesticide exposure, which was related to pesticide-induced oxidative stress and further lipid peroxidation of erythrocyte membranes where AChE is located. Such an effect cannot be attributed to OPs exposure for the reasons mentioned above. On the other hand, plasma cholinesterases showed higher levels in the period of high versus low pesticide exposure and in greenhouse workers as compared to controls. This finding can be interpreted as a homeostatic response intended to regulate acetylcholine at levels enough to maintain a low level systemic inflammation as a reactive mechanism of defense against exposure to pesticides. Both cholinesterases (plasma and erythrocyte), therefore, would act in a coordinated way in the termination of the cholinergic anti-inflammatory pathway controlled by acetylcholine. Regarding paraoxonase-1 (PON1), greenhouse workers had significantly higher levels of hydrolytic activity towards paraoxon (POase) and arylestersase (AREase) than controls, as well as in the period of high versus low exposure to pesticides. This higher PON1 activity was substrate-dependent (since lactonase -DHCase- exhibited a decreased activity) and might be attributed to an enhanced expression of the enzyme through nuclear receptors to counter the decreased AChE activity resulting from pesticide-induced oxidative stress. Thus, both esterases (PON1 and AChE) would also act in a coordinated manner. In relation to biomarkers of oxidative stress, higher levels of barbituric acid reactive substances (TBARS) and total thiol groups (SH-T) were observed in greenhouse workers compared to controls during the period of high pesticide exposure. However, the most striking finding was the increase in GGT in workers at the period of high exposure. These results suggest a certain degree of oxidative stress associated to pesticide exposure, likely generated during pesticide metabolism or by interference with antioxidant cellular defense systems. The present study suggests that GGT can be a sensitive biomarker of oxidative stress in relation to pesticide exposure. The biomarkers of nephrotoxicity studied did not suggest a glomerular involvement because levels of microalbuminuria, glomerular filtration rate (GFR), and serum creatinine and cystatin C failed to be associated with pesticide exposure. However, a subtle tubular change was suspected as osteopontin (OPN) and the factor trefoil 3 (TFF3) showed higher levels in the exposed workers than in controls and in the period of high versus low pesticide exposure. These results appear to reflect some impairment of tubular reabsorption or increased expression of both proteins as a result of renal tubular damage in relation to exposure to pesticides. However, other biomarkers of tubular damage (β2M, urinary cystatin C and NGAL) failed to show significant changes. As for biomarkers of hepatotoxicity, results were not conclusive. Although a slight increase in the transaminase AST was observed in greenhouse workers relative to controls in both study periods, thus reflecting some toxic hepatocellular involvement, the most striking result was a decrease in alkaline phosphatase, arginase I and GST-α levels in greenhouse workers relative to controls, which do not support a possible toxic hepatocellular damage. This decrease could be attributed to a hypothetical mechanism that regulates the expression of the three enzymes in a coordinated way, although its origin is far from being clear. The results of the neurotoxicity biomarkers studied (pNF-H and S100B) showed weak evidence of neurological involvement associated with pesticide exposure. This may be because greenhouse workers were not exposed to pesticides intrinsically neurotoxic. It is possible that this subtle change at both neuronal and glial level may be due to a greater permeability of the blood-brain barrier or to a certain degree of neuroinflammation, being in both cases secondary to a nonspecific response to pesticide exposure. Finally, in relation to the immunotoxicity biomarkers studied, the increase in proinflammatory cytokines and chemokines suggests that exposure to pesticides can induce a low-grade systemic inflammatory response, resulting in an increased production of inflammatory mediators and promoting the migration of inflammatory cells to tissues where the inflammatory process has been triggered. On the other hand, the increase in hematopoietic growth factors would induce angiogenesis by proliferation and activation of endothelial cells in tissues exhibiting an inflammatory response. However, the high percentage of undetected values of colony stimulating factors suggests that the inflammation produced was of low intensity and did not require the production and maturation of new inflammatory cells. This systemic inflammation may also increase the permeability of the blood-brain barrier and stimulate neuroinflammatory pathways, leading to some indirect neurotoxic involvement.