Papel del glutatión en la biología reproductiva del olivo

Resumen

Las especies de oxígeno reactivo (ROS) desempeñan importantes misiones en la fisiología vegetal. Históricamente, han sido conocidas por acumularse como consecuencia de diversos estreses, llegando a generar daño celular. Sin embargo, en la actualidad se conocen además numerosas funciones beneficiosas y necesarias (i.e señalización) que están empezando a ser descritas en los procesos reproductivos. Las células poseen una compleja red antioxidante compuesta tanto por enzimas como por moléculas no enzimáticas, que evitan que las ROS se acumulen en exceso, ocasionando daño a diversas biomoléculas. El glutatión es un metabolito multifuncional de bajo peso molecular, que juega un papel crucial como antioxidante, contribuyendo a la señalización redox, la modulación de la expresión génica y la regulación de diversas actividades enzimáticas. Sin embargo, se conoce poco sobre su papel regulador en los procesos reproductivos de las plantas. El glutatión se sintetiza mediante la acción secuencial de la g-glutamilcisteína sintetasa (g-ECS), y la glutatión sintetasa (GS). Existe una amplia red metabólica responsable del mantenimiento de la homeostasis redox y del nivel de glutatión en su estado reducido (GSH), que es la forma principal presente dentro de la célula. La enzima glutatión reductasa (GR) es responsable de la reducción del glutatión oxidado (GSSG) a GSH, que será utilizada por las enzimas glutatión peroxidasa (GPX) y glutatión S-transferasa (GST) para la detoxificación de ROS y la conjugación con xenobióticos, respectivamente. El objetivo general de la presente tesis se centra en el análisis del papel fisiológico del glutatión y de las enzimas de su metabolismo en las diferentes etapas del proceso reproductivo del olivo, uno de los cultivos más importantes en España. Con este propósito, se han utilizado nuevas herramientas genómicas y proteómicas disponibles y se ha analizado la expresión de los productos génicos más relevantes, su actividad, características moleculares y localización celular mediante un amplio panel de métodos moleculares, bioquímicos y celulares disponibles. Los análisis se han llevado a cabo en las anteras de olivo en distintos estadios de desarrollo, así como en polen maduro (dehiscente) y polen al que se ha inducido su germinación in vitro, a distintos tiempos desde su inicio. Además, como comparación se han realizado estudios funcionales en Arabidopsis. La finalidad última de la propuesta es la generación de modelos funcionales que determinen las relaciones básicas entre los diferentes agentes implicados en el metabolismo y laseñalización mediada por glutatión durante la microsporogénesis, la emergencia, el crecimiento y la orientación del tubo polínico. En primer lugar, se realizó una aproximación bioinformática para identificar los genes de interés (g-ECS, GS, GR, GPX y GST) a partir de diferentes bases de datos, incluido el transcriptoma reproductivo del olivo (reprOlive), y de una validación experimental realizada mediante PCR con oligonucleótidos diseñados a partir de secuencias parciales y 3'/5'-RACE. El análisis bioinformático consistió en la elaboración de alineamientos de las secuencias obtenidas entre sí y con heterólogos de interés, la generación de árboles filogenéticos, y la predicción de las estructuras secundarias y 3-D de las proteínas codificadas, de su localización celular y de sus posibles modificaciones postraduccionales incluyendo la fosforilación, S-nitrosilación potencial, acetilación, miristotilación o palmitoilación, así como posibles escisiones. Para ello se utilizó un amplio panel de herramientas bioinformáticas on-line. Estos análisis permitieron identificar tanto la presencia de isoformas conservadas como específicas en el polen del olivo respecto a tejidos somáticos o de algunas descripciones presentes en la literatura. En segundo lugar, se determinaron los perfiles de expresión de los genes de interés g-ECS, GS, GR, GPX y GST mediante experimentos de Q-PCR tras diseñar cebadores específicos. La determinación de los niveles de transcritos se realizó a partir de cDNA de anteras en diversos estadios de desarrollo del polen (células madres del polen durante la meiosis, tétradas, microsporas), en polen maduro, y en polen a distintos tiempos a lo largo de la germinación in vitro. A lo largo de estos estadios se determinó y cuantificó igualmente la presencia de los enzimas mediante Western blotting, utilizando para ello anticuerpos heterólogos desarrollados frente a formas conservadas de los enzimas de Arabidopsis. Además de los enzimas indicados, se determinó la presencia y los niveles de GSH y GSSG, en este caso mediante el uso de LC-MS. La información bioquímica obtenida fue complementada con la realización de estudios inmunocitoquímicos para determinar la localización celular tanto de los enzimas como del GSH, que está presente en los microsporocitos y otros tejidos de la antera (incluyendo el tapetum) a lo largo de todo el desarrollo, así como en el grano de polen y el tubo polínico, con una amplia distribución que incluye el citosol, las aperturas del polen y los núcleos con una notable intensidad. La localización nuclear del GSH parece sugerir la participación del GSH en el control del ciclo celular. Por último, se realizó un estudio comparativo del metabolismo del GSH en tres genotipos de Arabidopsis thaliana: un genotipo silvestre (WT), un mutante que expresa una proteína verde fluorescente sensible al estado redox (roGFP2), y un doble mutante deficiente en glutatión cad2-1 expresando simultáneamente el marcador redox (cad-1/roGFP2), cuyas flores tenían significativamente menos GSH y más GSSG que las flores WT o roGFP. El estima, estilo, antera, los granos de polen germinados y los tubos polínicos de las flores roGFP2 mostraron bajo nivel de oxidación, que sin embargo sí fue más alto en los mutantes cad-1/roGFP2. Los granos de polen sin germinar aparecieron más oxidados que los germinados, lo que indica que las células del polen incrementan su estado de reducción a lo largo de su activación metabólica. El porcentaje de germinación fue menor y el crecimiento del tubo polínico se detuvo antes en los mutantes cad-1/roGFP2 que en las plantas roGFP2, lo que demuestra que el crecimiento del tubo polínico precisa un estado esencialmente reducido. Los resultados obtenidos muestran que los granos de polen sin germinar presentan un estado relativamente oxidado comparado con los granos de polen germinados. Además, se demuestra que la no acumulación de GSH y el mantenimiento de una tasa GSH/GSSG alta tienen efectos negativos sobre la germinación del polen.