Effects of agroindustrial by-products on wood-dwelling agaricomyceteslignocellulolytic enzyme enhancement and residue transformation

Resumen

Numerosos hongos de la clase Agaricomycetes se encuentran entre los degradadores más eficientes de polímeros naturales recalcitrantes como los materiales húmicos y lignocelulósicos (Hibbett et al., 2007). Mediante un ataque oxidativo e hidrolítico, estos organismos son los únicos capaces de mineralizar todos los componentes poliméricos de la pared celular vegetal, atacando primero los compuestos de lignina (Kirk and Farrell, 1987) para tener acceso a la celulosa y hemicelulosa (Ten Have and Teunissen, 2001). Estos hongos se han clasificado tradicionalmente en dos grandes grupos según su capacidad de descomponer la lignocelulosa: los hongos de la podredumbre blanca y marrón (Pandey and Pitman, 2003). Tradicionalmente los hongos de la podredumbre blanca se consideraban los únicos responsables de mineralizar completamente la lignina mediante la producción de enzimas ligninolíticas (Cullen and Kersten, 2004), pero actualmente se incluye en este grupo stricto sensu a aquellos capaces de secretar peroxidasas de clase II (PODs) (Riley et al., 2014). El arsenal enzimático oxidativo implicado en el proceso ligninolítico incluye varias PODs, como la manganeso peroxidasa (MnP), lignina peroxidasa (LiP) y versátil peroxidasa (VP) (Hofrichter et al., 2010); además de otras oxidasas accesorias como lacasas y aryl alcohol oxidasas (Baldrian, 2006; Ferreira et al., 2009). Por otro lado, se está estudiando el posible papel en la degradación de la lignina de las recientemente descubiertas peroxidasas decolorantes de tintes (DyPs) (Liers et al., 2010) o las peroxigenasas inespecíficas (UPOs) (Ullrich et al., 2004). Además de esta batería de biocatalizadores, el ataque hidrolítico lignocelulósico requiere la participación de enzimas carbohidrato activas como celulasas, pectinasas y esterasas, entre otras, con el fin de completar dicha mineralización (Sanchez, 2009). Estas enzimas se encuentran clasificadas en grupos funcionales según la base de datos CAZy (carbohydrate active enzymes database) (McCartney et al., 2004). El hongo Chondrostereum purpureum es conocido fundamentalmente como un organismo de control biológico, sin embargo, su mecanismo enzimático es desconocido (Becker et al., 2005). Existen indicios de la capacidad para producir oxidorreductasas (Casieri et al., 2010).que manifiestan su capacidad para oxidar ciertos compuestos aromáticos, sin embargo, no hay ninguna referencia concreta a una actividad ligninolítica. También existe cierta controversia sobre su posición dentro del encuadre taxonómico de los Agaricomicetes. Se ha comprobado que los componentes poliméricos de ciertos residuos orgánicos pueden actuar como inductores de la secreción de algunas de estas enzimas de interés industrial. Concretamente, un subproducto fitotóxico y rico en ácidos fenólicos que proviene de la obtención del aceite de oliva como es el alpeorujo, puede actuar como inductor de lacasas en hongos como Coriolopsis floccosa (anteriormente Coriolopsis rígida (Díaz et al., 2010)). Además, se ha propuesto a este residuo fitotóxico, como potencial enmendante orgánico una vez transformado con hongos ligninolíticos, debido a su alto contenido en materia orgánica y minerales beneficiosos para plantas y suelo así como a una disminución del contenido tóxico en fenoles (Sampedro et al., 2009). En base a estos indicios, en esta tesis se plantea la hipótesis de un posible papel estimulador del alpeorujo en la secreción de las PODs y polifenol oxidasas, además de las novedosas DyPs y UPOs en hongos Agaricomicetes. También se sugiere una doble y concomitante valorización del mismo mediante su tratamiento con hongos de la podredumbre blanca: como inductor enzimático y fertilizante orgánico. En primer lugar se estudió el efecto de residuo de alpeorujo sobre el crecimiento y la producción de enzimas ligninolíticas e hidrolíticas de Trametes versicolor. Se llevó a cabo un análisis comparativo entre el alpeorujo y otro residuo análogo como el hollejo de uva (Mateo and Maicas, 2015), comprobando que el alpeorujo actuaba como sustrato estimulante de lacasas y PODs. Además el hongo producía una oxidación y polimerización de los compuestos aromáticos solubles presentes en el residuo (entre ellos muchos ácidos fenólicos) que desencadenaba una eliminación de la fitotoxicidad, al no ser captados por la planta. El hollejo de uva, a pesar de ser un medio apropiado para el crecimiento fúngico, no indujo ninguna enzima ligninolítica. En base a los resultados obtenidos en estos estudios, comprobamos el efecto del alpeorujo sobre la secreción de enzimas concretas: VPs, MnPs, DyPs y UPOs. Utilizamos dos hongos hipersecretores de UPO como Coprinellus radians y Agrocybe aegerita (Ullrich et al., 2004; Anh et al. 2007), otro hongo conocido por la secreción de VPs como Bjerkandera adusta (Sugano et al., 2009) y otros dos hongos cuya característica distintiva es la secreción de DyPs, como son Marasmius alliaceus y Auricularia auricular-judae (Liers et al., 2010). Además del anteriormente descrito Chondrostereum purpureum, desconocido taxonómicamente y respecto a su capacidad biocatalizadora. Entre los resultados obtenidos cabe destacar una inducción de PODs, lacasas y UPOs mediada por el alpeorujo. Sin embargo no se observaron cambios significativos en los patrones de secreción de DyPs ante la adición del subproducto fenólico. Estos resultados fueron la base para realizar estudios moleculares y proteómicos más detallados con el hongo B. adusta, que además de su capacidad de producir distintas y numerosas PODs, puede secretar producir una gran cantidad de DyPs. Se comprobó una regulación positiva de genes codificantes de MnPs y VPs y se purificaron dos isoformas de VPs en presencia del extracto acuoso del alpeorujo (BadVPI y BadVPII) que se probaron ante distintos sustratos aromáticos así como en la polimerización de ligninas sintéticas como el dehydropolímero. Con objeto de indagar en la capacidad degradativa, potencial enzimático, metabolismo y clasificación ecológica de C. purpureum, se llevó a cabo la secuenciación de su genoma en los laboratorios del Internationales Hochschulinstitut de Zittau (IHIZ) mediante un secuenciador de nueva generación Ion Torrent. Obtenido el genoma y realizado el ensamblaje, se llevó a cabo la anotación del mismo mediante distintos procedimientos bioinformáticos. Además se llevó a cabo el análisis de la inducción y represión de la batería de enzimas implicadas en la degradación de residuos agroindustriales lignocelulósicos mediante estudios proteómicos. Como resultado se pudo definir a C. purpureum como un hongo de la podredumbre blanca perteneciente al orden Agaricales, con capacidad de secretar numerosas enzimas ligninolíticas como UPOs, PODs y lacasas que se encuentraban positivamente reguladas por la presencia del alpeorujo. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Anh, D.H., Ullrich, R., Benndorf, D., Svatoś, A., Muck, A., Hofrichter, M., 2007. The coprophilous mushroom Coprinus radians secretes a haloperoxidase that catalyzes aromatic peroxygenation. Applied and Environmental Microbiology 73, 5477-5485. Baldrian, P., 2006. Fungal laccases – occurrence and properties. FEMS Microbiology Reviews. 30, 215-242. Becker, E., Shamoun, S.F., Hintz, W.E., 2005. 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