Mecanismo de resistencia a miltefosina en leishmaniacaracterización de la subunidad proteica liros3

Resumen

El mecanismo de resistencia más relevante descrito hasta la fecha que pueden desarrollar los parásitos del género Leishmania a la miltefosina (MLF, hexadecilfosfocolina), uno de los fármacos que más se emplean en la actualidad contra la leishmaniasis, consiste en la inactivación del complejo proteico encargado de su internalización. Este complejo se sitúa en la membrana plasmática de los parásitos y está constituido al menos por dos proteínas: una subunidad catalítica (MT, de Miltefosine Transporter), perteneciente a la familia de las fosfolípido translocasas o P4-ATPasas, y una subunidad beta (Ros3), perteneciente a la familia de proteínas Cdc50. En el caso de Leishmania infantum, especie utilizada a lo largo de los experimentos descritos en esta tesis doctoral, ambas proteínas se denominan LiMT y LiRos3, respectivamente. Nuestro laboratorio ha descrito anteriormente en Leishmania donovani que la pérdida de cualquiera de los ortólogos de estas dos subunidades (LdMT y LdRos3) o la ausencia de su expresión a nivel de la membrana plasmática conlleva elevados valores de resistencia a MLF por la incapacidad del parásito para incorporar este fármaco. De hecho, el nivel de sensibilidad in vitro a MLF está claramente relacionado con su tasa de captación y con el nivel de expresión de la proteína transportadora en la membrana del parásito. Las P4-ATPasas son responsables del transporte activo de glicerofosfolípidos desde la cara exoplasmática hasta la cara citosólica de las membranas de las células eucariotas, una función que comúnmente se denomina como actividad flipasa. Estas proteínas son esenciales para crear y mantener una distribución asimétrica de fosfolípidos a ambos lados de la membrana, un fenómeno que está asociado con numerosos procesos fisiológicos y celulares, así como para incorporar determinados lípidos exógenos o para la formación de las vesículas que forman parte del tráfico intracelular. Estas proteínas están siendo muy estudiadas en los últimos años en diferentes modelos, habiéndose obtenido importantes avances en el conocimiento de su mecanismo de acción. Aunque el papel de las proteínas Cdc50 no esté del todo aclarado, existen evidencias de su participación tanto en la salida del complejo del retículo endoplasmático como en el ciclo de reacción llevado a cabo por las P4-ATPasas. Al igual que las P4-ATPasas, las proteínas Cdc50 son proteínas integrales de membrana exclusivas de organismos eucariotas. Poseen una estructura muy conservada, estando constituidas por dos hélices transmembrana, un dominio extracitosólico de gran tamaño, estabilizado por dos puentes disulfuro y fuertemente N-glicosilado, y dos pequeñas colas dirigidas al citoplasma situadas en los extremos amino y carboxilo terminal. La caracterización de estas proteínas, que carecen de motivos aminoacídicos funcionales conocidos, se encuentra todavía en una etapa inicial, habiéndose realizado hasta la fecha muy pocos estudios moleculares dirigidos a la identificación de los residuos o dominios implicados en su funcionalidad. Debido a ello, el objetivo principal de esta tesis doctoral consistió en la caracterización de la proteína LiRos3, analizando el papel que desempeñan sus diferentes dominios y determinados residuos con un alto grado de conservación, con la finalidad de profundizar en la caracterización del complejo de transporte de miltefosina en Leishmania, que comenzó nuestro laboratorio hace ya más de diez años, y tratar de que los resultados obtenidos pudieran ser aplicables al estudio de las proteínas Cdc50 de otros organismos. Durante el trabajo que aquí se presenta, se han generado promastigotes mutantes nulos del gen LiRos3 que han permitido el estudio de diferentes modificaciones de la proteína, observando los fenotipos que se derivan de la expresión de las mismas, puesto que, para que se produzca el transporte de MLF, es esencial que tenga lugar la interacción entre LiRos3 y LiMT y que el complejo se exprese correctamente en la membrana plasmática del parásito. Estas modificaciones consistieron en la introducción mediante mutagénesis dirigida de sustituciones conservativas y no conservativas y en el empleo de proteínas quiméricas generadas sustituyendo los diferentes dominios de LiRos3 por los correspondientes dominios de los otros dos miembros de la familia Cdc50 de L. infantum, denominados LiRos1 y LiRos2. Se identificaron 22 residuos de LiRos3 conservados en las proteínas Cdc50 de humanos, levaduras y Leishmania y se realizaron mutaciones en todos ellos. Se observó que el nivel de conservación de ocho de estos residuos, localizados en el lazo exoplasmático, es crítico para la interacción con LiMT y el tráfico del complejo de transporte de MLF hacia la membrana plasmática. Al margen de este efecto, cuando se muta uno de estos residuos, que forma parte de un motivo invariable de N-glicosilación, también se altera la actividad translocasa de fosfolípidos. Además, otro residuo invariable localizado en el lazo exoplasmático y cuatro residuos localizados en el dominio N-terminal están implicados en esta actividad flipasa sin afectar a la llegada del complejo a la membrana plasmática. Por otro lado, se ha observado que el nivel de N-glicosilación de LiRos3 también puede afectar a la actividad translocasa y a la expresión de LiMT en la membrana plasmática. Además, se ha comprobado que los dominios amino y carboxilo terminal no son esenciales para la interacción con LiMT, pero sí se requieren para el correcto tráfico del complejo hacia la membrana plasmática. Aunque LiRos1 y LiRos3 tienen una baja identidad en la secuencia de aminoácidos, la sustitución de los dominios amino terminal, primer transmembrana y carboxilo terminal de LiRos3 por los correspondientes dominios de LiRos1 genera proteínas funcionales. Por el contrario, cuando se sustituyen los dominios extracitosólico y segundo transmembrana, se pierde la interacción con LiMT. Los resultados sugieren, como ya se había publicado anteriormente, que el dominio N-terminal de las proteínas Cdc50 juega un papel importante durante el ciclo de reacción de las P4-ATPasas. Además, se puede deducir que, para la correcta interacción con LiMT, aparte de los residuos identificados, se necesita de la participación de otros residuos aún sin identificar situados en los segmentos transmembrana y en el lazo extracelular de LiRos3. En conclusión, los resultados de esta tesis doctoral proporcionan nuevos y relevantes datos sobre la estructura de las proteínas Cdc50 y sobre el papel de determinados residuos en el tráfico y actividad de las P4-ATPasas translocadoras de fosfolípidos. Al margen de esto, los resultados obtenidos podrían ser de utilidad para mejorar el abordaje terapéutico de la leishmaniasis, considerada como la segunda enfermedad protozoaria humana más importante, tan solo por detrás de la malaria, con 12 millones de afectados en todo el planeta y responsable de entre 20.000 y 30.000 muertes al año. En la actualidad sigue constituyendo un grave problema sanitario, debido entre otras causas a su asociación con pacientes infectados por el VIH y al escaso arsenal terapéutico del que se dispone, amenazado además por la posibilidad de aparición de resistencias, como ha sucedido en el subcontinente indio frente a los antimoniales pentavalentes. En 2002 la MLF se introdujo como el primer fármaco oral usado frente a la leishmaniasis, presentando un porcentaje de cura aproximado del 95% en la India frente a la leishmaniasis visceral, la forma más letal de la enfermedad. Sin embargo, el porcentaje de pacientes que no responden al tratamiento ha experimentado un significativo aumento en los últimos años. Entre otras medidas a adoptar para evitar la propagación de resistencias y así alargar la vida útil de la MLF, se encuentra la necesidad de desarrollar marcadores de resistencia al fármaco con los que poder monitorizar la existencia de las mismas. En anteriores estudios se ha observado que L. donovani, cuando se somete in vitro a la presión selectiva del fármaco, puede generar rápidamente resistencia debida a la aparición de mutaciones de la proteína LdMT y, en menor medida, de LdRos3. Recientemente, se ha descrito resistencia a MLF en un caso de leishmaniasis visceral producida por L. infantum donde el parásito aislado portaba una mutación en LiMT. Por estos motivos, resultaría de gran interés analizar tanto los niveles de expresión de estas proteínas como buscar mutaciones que pudieran ser responsables de la resistencia a MLF en aislados clínicos. La caracterización de LiRos3 que se describe en esta tesis doctoral, y especialmente las mutaciones observadas que confieren resistencia a MLF, suponen un importante avance en este sentido, más aún si cabe teniendo en cuenta que se ha comprobado que este efecto se mantiene en las formas amastigotas intracelulares de Leishmania.