¿efecto del aumento mutacional sobre el reconocimiento de los motivos estructurales del arn de la región genómica 5¿, del virus de la hepatitis c, por factores bioquímicos¿

Resumen

En este trabajo de Tesis Doctoral se ha tratado de estudiar el efecto de la variabilidad sobre la integridad de las estructuras del genoma ARN del virus de la hepatitis C (VHC). En su documentación se han encontrado una serie de preguntas, como: ¿Cuándo una mutación es funcionalmente neutra o estructuralmente neutral? (Wagner and Stadler 1999) ¿Es posible arrastrar a la extinción un virus, aumentando y acumulando de mutaciones su genoma? (Perales, Agudo et al. 2011) ¿El umbral de tolerancia coincide con la crisis de su eficacia biológica y señala la extinción viral? (Schuster 2011). Si el aumento de la tasa de mutación arrastra a la población a la extinción, porque ocurre: ¿por acumulación de errores en el genoma o por acumulación de mutantes no viables en la población? (Tejero et al., 2010)(Ortega-Prieto, Sheldon et al. 2013) ¿Dónde está el límite de tolerancia a la mutación? (Sheldon, Beach et al. 2014). Los objetivos planteados en este trabajo de Tesis Doctoral se centran en intentar dar respuesta a la pregunta: ¿Qué cantidad de distorsión mutacional es capaz de tolerar un elemento estructural hasta dejar de ser funcional para el genoma ARN de una cuasiespecie viral? formulada a partir de todas estas cuestiones. Para el estudio se ha empleado un modelo de la región 1-542 del genoma del VHC, especialmente conservada a nivel de secuencia, rica en motivos y elementos estructurales (dsARN, pseudonudo, switch, E-loop etc…), que conforma un elemento de entrada interna al ribosoma (IRES), con un dominio responsable del reclutamiento de la subunidad ribosomal 40S. Se ha evaluado la integridad de los diferentes motivos presentes en esta región (a los distintos niveles estructurales), a través de las respuestas obtenidas con sondas bioquímicas, que reconocen y responden (con mayor o menor especificidad) a dichas estructuras. Se ha diseñado una estrategia que permita valorar la integridad estructural de la región frente a la variabilidad, en el marco poblacional que constituye la cuasiespecie viral. Empleando técnicas de PCR en condiciones mutagénicas se ha introducido variabilidad aleatoria en la población de secuencias genéticas del VHC1-542, generando poblaciones con ratios de mutaciones y complejidad poblacional crecientes. También se seleccionaron poblaciones del ARN del VHC genotipo 2a, extraídas de cultivos celulares transfectados con el virus, a pase 0, a pase 4 y a pase 4 tratados con ribavirina. Se estudiaron las respuestas de estas poblaciones con el fin de comparar el efecto de la variabilidad genética sobre la integridad estructural del genoma, in vitro y en cultivo tras una serie de pases. Además de tratar de evaluar el efecto de la variabilidad inducida por el uso de mutágenos exógenos, como la ribavirina, que arrastran los cultivos a la extinción viral. Los resultados obtenidos muestran cómo afecta la variabilidad genómica a la integridad de los motivos estructurales de la cuasiespecie viral, a su equilibrio conformacional y su efecto sobre el reclutamiento de la subunidad ribosomal 40S. Resumiendo, se ha demostrado que la variabilidad condiciona la viabilidad del conjunto estructural que forma el elemento IRES del VHC1-542/570 y su capacidad de reclutar la subunidad ribosomal 40S, lo que confirma los mecanismos de acción de la mutagénesis letal como estrategia terapéutica frente a virus de ARN como el VHC.