Aproximación al diagnóstico de causa de muerte mediante el estudio de marcadores bioquímicos, morfológicos e inmunohistoquímicos

Resumen

El daño cardiaco puede ser causa primaria de la muerte o resultado de otras patologías. El poder discernir entre uno y otro puede ayudar a lo hora de diagnostico clínico del fallecimiento y repercusiones legales en peritajes forenses o ayudar al esclarecimiento de autopsias blancas entre otros. El objeto de este estudio es poder evaluar en corazones de cadáveres la eficacia en cortes histológicos del marcadores PARP-1, NOGOA, Troponina T, Troponina I y liporeroxidación, bien solos (cortes histológicos) o junto con suero y líquido pericárdico de los 2 últimos además de CK-MB e Isoenzimas, para diferenciar entre causa y/o consecuencia del daño cardiaco mediante el análisis postmortem de dichos parámetros. INTRODUCCIÓN La muerte es el estadio final de una serie de eventos que conducen a una parada cardiaca. El diagnostico de Infarto de Miocardio (IM ) es particularmente fácil para el patólogo, cuando se ha producido un daño estructural y si ha trascurrido un tiempo suficiente para que puedan ser apreciados los cambios macro y microscópicos, pero difícil si la muerte se produce antes de que se produzcan dichos cambios, ya que estos no aparecen de forma inmediata desde el origen de la isquemia sino que para que se puedan detectar precisan un tiempo de supervivencia mínimo. Con las técnicas histológicas clásicas (como la tinción de hematoxilina-eosina la zona isquémica/infartada no se puede detectar hasta pasadas al menos 6 horas desde su inicio de la sintomatología); problema que se plantea en gran mayoría de casos, produciéndose la muerte sin que de tiempo a que se ponga de manifiesto los cambios macroscópicos y microscópicos a nivel miocárdico. Cuando un individuo fallece de muerte súbita, la principal causa en el 90 % de los casos es cardiaca y dentro de esta en un 95 % nos encontramos una cardiopatía estructural, siendo la de origen isquémico la que representa el 80 % de los casos. Considerar que en el 5 % de las autopsias en los casos de muerte súbita e inesperada tras realizar un estudio médico legal completo no es posible averiguar la causa de muerte, son clasificadas como autopsias blancas que pueden llegar al 30 % de los casos en adultos jóvenes. Haciendo en la practica la una necesidad de test más sensitivos y específicos que ayuden al diagnostico de causa de muerte (Martínez et al., 2005). En la práctica forense para el diagnóstico de la causa de muerte puede ser suficiente con el estudio macroscópico, microscópico y bioquímico en tejido o diferentes fluídos. No obstante, el diagnóstico definitivo suele requerir determinaciones complementarias de troponinas, CKMB e isoenzimas y mioglobinas (Aissaoui et al., 2013; F. Martínez et al., 2005; Osuna et al.,1998a,b,c; Pérez-Cárceles MD et al., 2004). Además en bastantes ocasiones los estudios morfológicos cardiacos no pueden diferenciar a individuos que han sufrido un traumatismo de aquellos que han tenido una muerte por un proceso cardiaco. El objeto de este estudio es poder evaluar en corazones de cadáveres la eficacia en cortes histológicos de los marcadores PARP1, NogoA, Troponina T, Troponina I, y Lipoperoxidación, solos (cortes histológicos) o bien junto con determinación en suero y líquido pericárdico de los 2 últimos enumerados además de CK-MB e Isoformas, para diferenciar entre causa primaria y/o consecuencia desencadenante del daño cardiaco mediante el análisis post mortem de dichos parámetros. Poder conocer y diferenciar entre ambas puede tener altas repercusiones desde el punto de vista legal y clínico. Sea este un certificado de defunción, un peritaje legal ante un accidente de tráfico, o casos criminales en un estudio forense entre otros. Las células detectan y responde a las agresiones del medioambiente estableciendo una rápida respuesta de estrés activando el enzima nuclear Poli(ADP Ribosa- polimerasa)-1 (PARP1). Es una de las enzimas nucleares más abundantes presentes en células eucariotas que desempeña varios roles entre ellos “la ADP- ribosilación de proteínas” una modificación postranslacional que ocurre primariamente como respuesta al daño del ADN. (Luo & Kraus., 2012). Un sensor interruptor molecular de daño de ADN que inicia la reparación por escisión de bases (Jagtap & Szabo 2005; Schreiber et al. 2006; Szabo et al. 2006; Virag 2005; Virag & Szabo 2002,2003). Sin embargo, ante el daño isquémico se produce un exceso en su activación y la inducción de muerte por necrosis o muerte celular programada de las células. Se han propuesto diferentes mecanismos para que se active una vía u otra. Uno de ellos va a depender de la hipersintesis de PARP por PARP-1 proporcionando energía suficiente a la célula (NAD+ y ATP) para seguir la vía de la apoptosis mediante la activación de la caspasa. O la depleción de la energía con vía hacia la necrosis (Decker and Muller 2002; Bouchard et al. 2003). La isquemia repercusión acentúa el daño tisular y la disfunción de órganos (Downey, 1990) produciendo un aumento de Radicales Libres del Oxigeno (RLO). Un estrés oxidativo alto es común en los órganos y tejidos con grandes demandas metabólicas y de energía, incluyendo el músculo cardíaco como consecuencia del agotamiento del ATP (Carden, 2000; Kloner, 1974). La reversibilidad del proceso estará en función de la extensión y el tiempo que dure la isquemia, aunque lo previsible es que una reperfusión precoz restablezca rápidamente la función celular restaurando el equilibrio electrolítico y minimice el daño celular. Sin embargo, se produce un aumento paradójico como respuesta a la reperfusión (reoxigenación) (Reimer, 1977). La reentrada de oxígeno en el tejido produce más daño que la propia isquemia. Esto se debe a un desequilibrio entre la tasa de generación de RLO y la capacidad del tejido para desintoxicar estos Radicales Libres (Guarnieri et al., 1980; Granger et al., 1981, 2010; Granger & Kvietys, 2015). El exceso de RLO provoca daño celular por incrementar la peroxidación de lípidos, entre otros mecanismo. PARP1 está relacionado con los procesos patológicos derivados de diferentes respuestas inflamatorias. (Virág & Szabó, 2002; Szabó & Dawson, 1998; Oliver et al., 1999). Una característica común a todos estos procesos relacionados con la inflamación es la liberación de mediadores proinflamatorios y la formación de radicales libres. Consecuencia de ello, es la formación de radicales superóxido (O2-) e hidroxilo (OH-) que interaccionan con el óxido nítrico sintetizado (producto de la actividad de la isoforma inducible de la Óxido Nítrico Sintetasa, iNOS) dando lugar a peroxinitrito (ONOO-). Este compuesto es un potente activador de PARP1 que ocasiona depleción energética en la célula y por tanto necrosis, favoreciendo los procesos inflamatorios y estrés oxidativo. La expresión de mediadores proinflamatorios a su vez, recluta más células (PMN neutrófilos) al foco inflamatorio, aumentando los efectos del estrés oxidativo, de manera que se produce una retroalimentación positiva que amplifica enormemente este estado. Estos radicales libres producen oxidación y daño del DNA y como consecuencia activación de la enzima PARP1 (Berger et al., 1983; Evgenov & Liaudet., 2005). La ausencia total de infiltrado inflamatorio agudo en las biopsias de corazones en el grupo de infarto de miocardio con muerte súbita podría explicar en parte que los valores de expresión de PARP1 no sean elevados. La relación entre PARP1 y estrés está demostrada (Pieper et al., 1999, 2000; Gilad et al., 1997; Ha et al., 2002). En nuestro estudio hemos pensado que la producción de radicales libres es diferente dependiendo de cuál sea la causa de muerte o como se haya producido está, lo que puede ayudar a establecer el diagnóstico de la causa de muerte. Junto con el marcador PAR-1 relacionado con los procesos de reparación nuclear, apoptosis y oxidación reducción. Estos últimos forman radicales libres durante el estrés oxidativo, que inician la peroxidación de los lípidos. Ambos parámetros PARP-1 y Lipoperoxidación forman parte de 2 etapas de un proceso y podrían ayudar a la diferenciación de causa versus consecuencia. Nogo A se ha descrito casi exclusivamente en el Sistema Nervioso. Inhibe el citoesqueleto neuronal y el crecimiento de neuritas, enlentece la regeneración axonal, inhibe la formación de glía y axones, ramificaciones dendríticas, la diferenciación de oligodendrocitos y mielinización. Está Implicado en enfermedades neurodegenerativas y posee un efecto negativo en lesiones SNC (traumatismos, ACV) (Bullard et al., 2008; Craveiro et al., 2008; Lee & Gustafsson, 2009). METODO Para las muestras de PARP1 y Lipoperoxidación hemos estudiado una serie retrospectiva de 92 corazones de cadáveres (66 varones y 26 mujeres con edades comprendidas entre 12-87 años edad media de 50.54 % +,- 2,01: DS18.6) cuya causa de muerte era conocida: 12 asfixias por ahorcadura, 23 infartos de miocardio, 14 muertes por asfixia por sumersión, 23 muertes por traumatismo torácico y 20 muertes de causas naturales. Se tomaron muestras de 9 zonas cardiacas diferentes para la realización de PARP-1 y 11 sitios distintos, junto con líquido pericárdico y suero para realización de lipoperoxidación. Para las Muestras en cortes histológicos de NOGOA, Troponina I y Troponina T las muestras de ampliaron a un total de 177 corazones. Para el análisis se utilizaron criterios actuales como morfológicos e histológicos (edema, bandas de contracción, hemorragia, atipia, infiltrados linfocitarios y PMN) además de los que son objeto de este estudio (inmunotinción histológica en tejido fijado en parafina de PARP-1 y lipoperoxidación histologica, suero y líquido pericardico). Los datos se compararon con los diagnósticos conocidos y se analizaron mediante SPSS utilizando análisis, grafico, pruebas χ² para variables categóricas, Test de Kruskal-Wallis y Mann-Whitney para variables no paranéfricas, coeficiente de correlación de Spearman para las variables aleatorias continuas y curvas ROC RESULTADOS En el estudio histopatológico ninguna de las variables morfológicas estudiadas en las secciones miocárdicas (hipercromatismo y displasia nuclear, vacuolización citoplásmica, bandas de contracción y necrosis de miocardiocitos, infiltrado inflamatorio, edema y hemorragias han mostrado diferencia estadística significativa con respecto a la causa de la muerte ni ha mostrado relación con los parámetros inmunohistoquímicos o bioquímicos analizados. Los resultados del estudio estadístico analítico de los niveles de expresión bioquímicos de CK-MB en fluidos fueron significativos para la separación entre grupos para suero (p=0.000, Kuskal-Wallis test) y líquido pericárdico (p=0.033, Kuskal-Wallis test) siendo del primero solo significativo para la separación de parejas entre traumatismos y asfixias por sumersión (p=0.028, prueba U de Mann-Whitney).Mientras que el líquido pericárdico pudo separa infarto de miocardio frente a asfixia mecánica por ahorcadura (p=0.031, prueba U de Mann-Whitney), asfixia por sumersión (p=0.002, prueba U de Mann-Whitney) y otras causas de muerte natural (p=0.004, prueba U de Mann-Whitney). Idénticos resultados se alcanzaron para la determinación de las isoformas de CK-MB (CK-MBmb1 y CK-MBmb2 en líquido pericárdico) En tejido cardíaco la detección inmunohistoquímica de la troponina T no fue significativa. Si la Troponina I en intensidad y área de extensión (p<0.025, Kuskal-Wallis test) para la separación de parejas entre traumatismo y otras causas de muerte natural (p=0.030, prueba U de Mann-Whitney). La expresión nuclear de PARP1 fue detectada mediante inmunohistoquímica en el 96.5% de los casos en alguna de la áreas estudiadas. La valoración semicuantitativa de la expresión en intensidad nuclear en miocardiocitos de PARP1 fue significativa para la diferenciación entre grupos (p=0.011, Kuskal-Wallis test). La intensidad fue mayor en el grupo de muerte por causa asfíctica por sumersión pudiendo separar significativamente por comparación de parejas con asfixias mecánicas por ahorcamiento (p=0.011, prueba U de Mann-Whitney). Esta última con valores más bajos. Encontrando que las muertes por infarto, traumáticas y muertes por causa natural presentaron valores intermedios. La variable calculada de Intensidad por extensión del área de PAR1 presentó resultados similares para los mismos Los niveles de lipoperoxidación lipídica en líquido pericárdico no mostraron diferencias estadísticamente significativas, si lo fueron en suero para la separación de grupos (p=0.000 Kuskal-Wallis test). Diferenciando en comparación por parejas las causas de muertes naturales frente a asfixia mecánica por ahorcadura (p= 0.024 prueba U de Mann-Whitney ) e infarto de miocardio (p= 0.000 prueba U de Mann-Whitney), siendo marginal frente al grupo de asfixia por sumersión (p= 0.076 prueba U de Mann-Whitney). No fue significativo frente a traumatismo. Al analizar la variable transformada de lipoperoxidación lipídica en suero menos líquido pericárdico encontramos una significación estadística para la separación de grupos de (p=0.000 Kuskal-Wallis test). Diferenciando en comparación por parejas las causas de muertes naturales frente a asfixia mecánica por ahorcadura (p= 0.044 prueba U de Mann-Whitney), a asfixia por sumersión ( p= 0.024 prueba U de Mann-Whitney), y a traumatismo (p= 0.000 prueba U de Mann-Whitney). No fue significativo frente a infarto de miocardio. Hubo significación estadística para cada una de las 11 áreas cardiacas analizadas siendo la media de la peroxidación hística de las 11 zonas cardiacas analizadas la de valores más robustos para la separación entre grupos (p=0.000 Kuskal-Wallis test). Diferenciando en comparación por parejas las causas de muertes naturales frente a infarto de miocardio (p= 0.000 prueba U de Mann-Whitney), a asfixia por sumersión (p= 0.031 prueba U de Mann-Whitney), y a traumatismo (p= 0.004 prueba U de Mann-Whitney). No fue nada significativo frente a asfixias mecánicas por ahorcadura. La expresión Inmunohistoquímica de Nogo A en tejido Cardiaco No Mostró diferencias estadísticamente significativas entre las 5 causas de muerte analizadas. Sin embargo al estratificarlo según forma de producirse la muerte (natural, accidental y suicida) fue significativo (p=0.011 Kuskal-Wallis test). En análisis de comparación de parejas permitiría distinguir entre muertes producidas de forma natural frente al resto. Se realizaron curvas ROC para aquellos parámetros más significativos y que a su vez fueron objetivo de nuestro trabajo. Se hicieron para la Intensidad de PARP1 y Lipoperoxidación. Para la variable del valor medio de la Intensidad de PARP1 de las en las 9 zonas de tejido cardíacas. El punto de corte que optimiza la sensibilidad y especificad es el valor 2.94. Logro separar las asfixias por sumersión frente al resto de grupos con un área bajo la curva de 0,77 Para la variable Peroxidación .media tisular el punto de corte que optimiza la sensibilidad y especificad es el valor 187.22 nmol/g con un área bajo la curva de 0.83 para la separación entre otras causas de muerte frente al resto de grupos. La curva ROC de la lipoperoxidación en suero para el grupo de otras causas de muerte frente al resto de grupos tuvo un área bajo la curva de 0.92 para un punto de corte de 19.25 nmol/g. DISCUSSION El intervalo post-mortem interfiere con los resultados analíticos debido a los fenómenos de autólisis. (Pérez-Cárceles et al., 1995; Osuna et al., 1998, 1999) No encuentra modificación en los valores analíticos para intervalos post-mortem inferiores a 72 h. En nuestro estudio no ha habido interferencia debido al corto intervalo post mortem Intervalo post-mortem 7.48±4.16 horas (buena conservación del cadáver y de las muestras, procesamiento). Zhu, (2007) encuentra alteraciones del intervalo post mortem Las troponinas cardíacas constituyen en la actualidad el nuevo criterio de referencia en del infarto agudo de miocardio, debido a su alta eficacia diagnóstica. Las troponinas cardioespecíficas muestran una muy alta sensibilidad y especificidad como marcadores de necrosis miocárdica, tanto en pacientes con o sin diagnóstico electrocadiográfico (Hillis & Fox, 1999; Wu et al., 1999; Gerhardt et al., 1998). La tercera y última definición universal del Infarto de miocardio (Thygesen et al., 2012). Expresa que la definición del término”Infarto agudo de miocardio (IAM)” se debe utilizar cuando hay evidencia de necrosis miocárdica en una clínica compatible con isquemia miocárdica aguda. A su vez se subclasifica el IM en 5 subgrupos Niveles elevados de suero cTn indican necrosis miocárdica independientemente de la fisiopatología subyacente. (Thygesen et al., 2012). El poder subestratificar en un fututo las distintas patologías de este grupo puede dar mayor información en un futuro ya que actualmente no pueden diferenciar entre causas traumáticas e infarto de miocardio. El marcador PARP1 relacionado con los procesos de reparación nuclear, apoptosis y oxidación reducción (estos últimos forman radicales libres durante el estrés oxidativo (Pieper, 2000, Pacher ,2007 et al Rubbo, et al 2005. Zhang & Kaufman 2008) que inician la peroxidación de los lípidos (Kirkland, 1994) puede expresar distinta intensidad según la forma en que se haya producido la muerte y la vía celular seguida por esta. Ambos parámetros PARP1 y Lipoperoxidación forman parte de etapas consecutivas de un mismo proceso con un doble sentido (activación de PARP-1 por los radicales libres o creación de radicales libres por PARP1). (Tóth-Zsámboki E. et al 2006). La activación de PARP1 se realiza de forma súbita (empieza a activarse a partir de los 2 minutos, la máxima intensidad estaría en una hora (Yang et al., 2000; Liaudet et al., 2001). En casos de isquemia / reperfusión, tras la reperfusión se presentaría antes de una hora manteniéndose hasta las 24h (Szabo et al., 2002; Pieper et al., 2000; Liaudet et al., 2001). Existiendo un factor cronodependiente. En nuestra serie de los corazones de cadáveres hemos demostrado que la expresión media de la intensidad inmunohistoquímica de PARP1 tuvo 2 valores extremos, uno superior en las muertes por asfixia por sumersión, otro inferior para las asfixias mecánicas por ahorcadura, en comparación con el resto de causas que tuvieron valores intermedios. Pensamos que las diferencias obtenidas entre los distintos tipos de asfixias se debe a el tiempo en que el cadáver tarda en morir y la vía seguida por PARP1 lo cual pone en expresión distintos niveles de marcador. Este patrón de retraso y mantenimiento en la activación de PARP1 es debido a la continua presencia de radicales libres tras la reperfusión miocárdica. La zona donde había más activación de PARP1 era el área de necrosis y zona periinfarto. La mayoría de la tinción de PARP1 fue vista en los miocardiocitos cardiacos (Pieper et al., 2000; Liaudet et al., 2001) lo que indica que lo miocardiocitos producen PARP1 por si solos además de las infiltración de células mononucleares implicadas en la activación. El hecho de que en los casos de infartos con muerte súbita los fenómenos de reperfusión hayan sido poco relevantes, también pueden justificar los valores menos elevados de PARP1 encontrados en músculo cardíaco en estos casos. Fue encontrado significativamente los valores inferiores de peroxidación lipídica en el grupo de otras causas de muertes. Al contrario de lo que pasa con otros marcadores donde el líquido pericardico identifica mejor el fenómeno vital en el caso de la lipoperoxidación no fue estadísticamente significativa. Siendo el suero mejor medio. En la separación de grupos el mejor poder discriminante lo dio la media de la lipoperoxidación hística (con P=0.000 Prueba de Kruskal-Wallis). Las 11 muestras analizadas en las distintas áreas cardiacas, todas fueron estadísticamente significativas. Con una P<0.005 Prueba de Kruskal-Wallis. (Otras causas de muerte vs resto, excepto Asfixias por ahorcadura) .La variable transformada de la lipoperoxidación de suero menos la del líquido pericárdico pudo separar estadísticamente el grupo de otras causas de muerte del resto de grupos salvo Infarto de Miocardio. La combinación de ambos parámetros PARP1 y Lipoperoxidación nos ayudo a diferenciar de forma estadística significativa a 3 de los 5 grupos estudiados. Para poder separar todos los grupos quedaría pendiente de separar “Traumatismos frente a Asfixias por sumersión Pensamos que el continuo agotamiento y desgaste de la enfermedad en los pacientes que han muerto por causas naturales puede producir un agotamiento de la disponibilidad de energía al menos a nivel del núcleo celular o la aparición de mecanismos compensadores neutralizantes también agotados que hacen que en dicho grupo los valores estén más bajos. Los radicales libres actúan sobre la membrana celulares y organelas destruyendo sus membranas y liberalizando su contenido, la mayor cantidad de ellos se encuentra en lisosomas como peroxisomas o en las mitocondrias. Esta liberalización del contenido se realiza de forma directa tras injurias externas o internas por activación de mecanismos como en el caso de PARP1 actuando sobre el potencial de membrana de las mitocondrias, conduciendo hacia la necrosis. La medida de lipoperoxidación en distintas zonas cardiacas o fluidos también nos ayuda a diferenciar la causa de muerte. Nogo-A se expresa en cardiomiocitos (adulto y neonatales) incrementa su expresión en corazones con miocardiopatía dilatada y en isquemia cardíaca se incrementa su expresión tras I/R. Modelos experimentales con ratones Knockout tras I/R: Disminuye la fragmentación del ADN. Previene la inducción de radicales libres del oxígeno, e inhibe caspasa 3 sin afectar al estrés del RE. Debido a la escasa información sobre la expresión en tejidos cardiaco de NogoA, se desconoce el papel que este marcador pueda jugar a nivel cardiaco. CONCLUSION 1. Los fenómenos autolíticos no interfieren significativamente en las concentraciones de los marcadores bioquímicos analizados en el período post mortem utilizado. 2. La valoración morfológica aislada de las lesiones en corazones de cadáver no encuentra relación con los parámetros bioquímicos analizados ni ha permitido identificar la causa de la muerte en nuestra serie. 3. Los valores de CK-MB y de la isoforma cardíacas MBmb2 en suero pueden ayudar a diferenciar las muertes por asfixia por sumersión de las muerte a consecuencia de traumatismos. 4. La determinación de troponina I en líquido pericárdico y CK-MB en suero y líquido pericárdico han mostrado un rendimiento diagnóstico post mortem para diferenciar causas de muerte de origen cardíaco de otras causas de muerte, excepto para las de origen traumático. 5. El comportamiento de las isoformas enzimáticas MBmb1 y MBmb2 en líquido pericárdico es muy semejante para apoyar el diagnóstico diferenciar post mortem de la causa de muerte de origen cardíaco, separándola de otras causas de muerte, excepto en muertes de etiología traumática y asfixias por ahorcadura. 6. La determinación de troponinas T en suero, Líquido pericárdico y en tejido cardíaco no ha mostrado un rendimiento diagnóstico post mortem suficiente para establecer el diagnóstico diferencial entre causas de muerte de origen cardíaco del resto de causas de muerte valoradas en este estudio. 7. La determinación de la peroxidación lipídica en suero, líquido pericárdico y tejido cardiaco facilita el diagnóstico diferencial post mortem entre causas de muerte natural del IM, accidentales (traumatismos, asfixias) o suicidas. 8. Encontramos mayores concentraciones de los diferentes marcadores en líquido pericárdico. La difusión de estos marcadores a este fluido es más precoz e intensa que al suero, por lo que unido a las características de producción, su función fisiológica y la situación de este fluido le convierte en el fluido de elección en el diagnóstico de necrosis miocárdica en la práctica forense. 9. La expresión inmunohistoquímica de troponinas T y Nogo-A en tejido cardíaco de cadáver valorada semicuantitativamente y mediante análisis de imagen no alcanza diferencias estadísticamente significativas para poder utilizarlas como técnica complementaria en el diagnóstico de causa de muerte de origen cardíaco. 10. Los niveles de expresión nuclear de PARP1 mediante inmunohistoquímica en tejido cardíaco pueden contribuir a identificar entre diferentes causas de muerte de origen asfíctico (diferencia asfixia mecánica por ahorcadura de asfixia por ahogamiento). 11. La investigación bioquímica en el cadáver siempre debe utilizarse como herramienta diagnóstica complementaria en la autopsia y debe ser contrastada e interpretada con el examen anatomopatológico.