Modelos experimentales de terapia génica para HIGM1 con vectores lentivirales transcripcionalmente regulados

Resumen

Las inmunodeficiencias primarias (PID) son un grupo heterogéneo de enfermedades que resultan de las mutaciones acontecidas en un grupo de unos 300 genes (Zhang et al., 2013; Ghosh et al., 2015) y que se caracterizan por causar defectos de distinta graduación en el desarrollo y/o función de las células inmunológicas. La marca característica de las PID es una susceptibilidad, generalmente creciente, a infecciones oportunistas, recurrentes y severas, aunque las hay también que se distinguen por causar una desregulación inmunológica, autoinmunidad y susceptibilidad a tumores linfoproliferativos entre los síntomas principales de su presentación clínica. Las formas más severas de PID son las denominadas inmunodeficiencias combinadas severas (SCID), que provocan un desarrollo defectuoso de las células T y un funcionamiento anormal de las células B. A menudo el tratamiento se limita a la aplicación de terapias paliativas, esencialmente basadas en la administración de antibióticos profilácticos o el reemplazamiento de inmunoglobulinas. El único tratamiento efectivo y curativo es el trasplante de médula ósea de un donante HLA idéntico (Notarangelo et al., 2010). Sin embargo, este tipo de donantes no siempre están disponibles para los pacientes y las probabilidades de éxito disminuyen mucho cuando la médula ósea proviene de los progenitores o de donantes no HLA idénticos (Notarangelo et al., 2010). A causa de esto, la aparición de la terapia génica en el campo de la biomedicina ha supuesto una importante contribución terapéutica para estos pacientes. Los síndromes de híper-IgM con déficit de IgG (HIGM), originalmente denominadas disgammaglobulinemias (Rosen et al., 1961), son un grupo de enfermedades con carácter de inmunodeficiencias primarias y que se distinguen por una señalización defectuosa vía CD40 en los linfocitos B. Como consecuencia, los pacientes de HIGM presentan niveles séricos bajos de IgG e IgA y altos o normales de IgM (Winkelstein et al., 2003). En consecuencia, los pacientes del síndrome de híper-IgM ligado al cromosoma X o HIGM1 (nº OMIM 308230) especialmente susceptibles a infecciones oportunistas (Etzioni and Ochs, 2004). HIGM1 es el más común de los síndromes HIGM (65-70% de todos los casos) y se produce por mutaciones en el gen codificante de la molécula CD154, también conocida como CD40 Ligando (Allen et al., 1993). CD40LG se localiza en el brazo largo del cromosoma X (Xq26-27). La severidad de HIGM1 y el hecho de que la expresión temporal de CD154 en la superficie de linfocitos T CD4+ esté fuertemente regulada (Lane et al., 1992; Castle et al., 1993) denotan la importancia funcional de la señalización desencadenada por la interacción de CD154 con su ligando, CD40, expresado constitutivamente en la superficie de células B. Esta interacción es esencial para el correcto desarrollo de los procesos inmunobiológicos de los linfocitos B, incluyendo el cambio de isotipo de las inmunoglobulinas (Foy et al., 1996), la proliferación celular y la supervivencia a la apoptosis. La molécula CD154 funcional se ensambla en homotrímeros (Protein Data Bank #1 ALY). Su estructura espacial es similar a la de las proteínas pertenecientes a las familias de TNFα y LTα. Aunque CD154 se produce fundamentalmente como una proteína transmembrana tipo II también puede ser expresada en la superficie celular como un complejo heteromultimérico (Hsu et al., 1997) o como dos isoformas solubles más cortas (Mazzei et al., 1995). Tal y como se ha mencionado previamente, la expresión de CD154 posee un control regulatorio muy sensible, que se logra a través de estrictos mecanismos moleculares, lo que ha dificultado el desarrollo de una terapia génica para HIGM1, dado que la expresión no regulada del transgén terapéutico ha provocado síndromes linfoproliferativos en los modelos animales (Brown et al., 1998; Sacco et al., 2000). La terapia génica consiste en el proceso de reinfusión de células autólogas modificadas para lograr alcanzar una expresión adecuada del gen defectuoso, normalmente mediante la inserción de una secuencia de cDNA en el genoma del hospedador para corregir el fenotipo de la enfermedad. Los primeros ensayos de terapia génica para PIDs se llevaron a cabo usando vectores oncorretrovirales (Cavazzana-Calvo et al., 2000), que son versátiles herramientas para entregar ácidos nucleicos. Los vectores retrovirales usados más comúnmente se basan en el virus de la leucemia de Moloney (MLV). Los genes de MLV se remplazan por un cassette de expresión para producir vectores gammarretrovirales incapaces de replicarse por sí mismos tras su inserción en el genoma de la célula hospedadora (Self-Inactivating Vectors, SIN). No obstante, los vectores retrovirales tienen algunas desventajas como herramientas terapéuticas en comparación con los vectores lentivirales, que están basados en los retrovirus HIV. Por ejemplo, mientras que los gammarretrovirus no pueden transducir células quiescentes (Roe et al., 1993), los lentivirus sí pueden (Lewis et al., 1994). Además, los gammarretrovirus tienden a insertarse cerca de islas CpG y sitios de inicio de la transcripción, especialmente de aquellos implicados en el desarrollo del cáncer (Laufs et al., 2003), al tiempo que los vectores lentivirales evitan esas localizaciones del DNA (Suerth et al., 2012). Si consideramos que los vectores oncorretrovirales suelen portar un transgén controlado por un promotor fuerte que asegure su expresión, es fácil entender por qué la transactivación de protoncogenes como LMO2 y la posterior mutagénesis insercional fueron consecuencias probables del uso de vectores gammarretrovirales en los primeros estudios clínicos de terapia génica (Hacein-Bey-Abina et al., 2003b; Check et al., 2005). Éste es el motivo de que nuestro grupo de investigación desarrollara un vector lentiviral (pCD40L-CD40L) de segunda generación, de expresión tejido-específica e inducible por activación, portador de una secuencia de cDNA obtenida de CD40LG y regulada por su propio promotor endógeno como primer paso para desarrollar una terapia génica regulada para HIGM1 (Romero et al., 2011). Este vector lentiviral incrementa la bioseguridad del protocolo, ya que su ensamblaje depende de una estrategia de genoma partido o separado de segunda generación (donde las células empaquetadoras 293T son cotransfectadas con el plásmido terapéutico, un plásmido empaquetador y plásmido para la envuelta viral). Esta estrategia reduce sustancialmente las probabilidades de que se produzcan espontáneamente lentivirus con una nueva capacidad de replicación (RCL) tras la inserción del transgén en el genoma de la célula hospedadora. Más aún, la estrategia de terapia génica en la que el transgén está dirigido por su propio promotor endógeno, en lugar de uno fuerte, permite la obtención de una expresión fisiológica, tal y como ha sido previamente demostrado en otros modelos de PID y en varios estudios clínicos como el síndrome de Wiskott-Aldrich (WAS) (Martín et al., 2005; Hacein et al., 2015). Además, esta estrategia también disminuye las posibilidades de transactivación si el sitio de inserción se encuentra en las proximidades de un protoncogén. El vector lentiviral regulado pCD40L-CD40L demostró ser capaz de restaurar una expresión fisiológica de CD154 in vitro en líneas celulares derivadas de pacientes de HIGM1 (Romero et al., 2011). Sin embargo, nos preocupó los relativamente bajos niveles de expresión de CD154 en la superficie celular obtenidos por el vector regulado. El objetivo de esta Tesis Doctoral ha sido tratar de determinar las causas de esta ineficiente expresión de CD154 en células humanas y averiguar si la expresión regulada de este gen puede conseguirse en otras especies, como es el caso de la murina. Por tanto, la línea celular Jurkat CD154- y células T primarias CD4+ aloespecíficas derivadas de pacientes de HIGM1 fueron transducidas con el vector regulado pCD40L-CD40L y el vector constitutivo pSFFV-CD40L. A pesar de que se logró una transducción eficiente de estas células y de que se detectaron altos niveles de mRNA procedentes de la transcripción de los vectores regulado y constitutivo (determinados por PCR cuantitativa a tiempo real), los niveles de expresión de CD154 en la superficie celular logrados por el vector regulado fueron relativamente bajos en células Jurkat deficientes para CD154 y en células T HIGM1, tal y como se pudo comprobar por citometría de flujo. Una de las líneas de células T derivada de pacientes HIGM1 (PH2) presenta una mutación que predice un transcrito carente del exón 3 de CD40LG. La amplificación por PCR del RNA retrotranscrito procedente de células PH2 produjo dos bandas que aparentemente no coinciden con el tamaño del transcrito obtenido de linfocitos T derivados de un individuo sano (N1) o de células Jurkat estimuladas transducidas con el vector regulado pCD40L-CD40L. Es interesante que, cuando las células PH2 fueron transducidas con el vector regulado pCD40L-CD40L, apareció una tercera banda del tamaño esperado como producto de amplificación. La secuenciación de estas bandas de DNA reveló que a la banda más corta le faltaba el exón 3, lo que es consistente con la mutación del paciente. Por otro lado, las otras dos bandas poseen la secuencia completa exónica de CD40LG, lo que indica que la transcripción del exón desaparecido ahora sí se produjo, aunque la banda superior, también expresada en células no transducidas, mostró una movilidad electroforética alterada. Para comprender mejor los mecanismos subyacentes a esta expresión inespecífica, construimos un panel de vectores bicistrónicos donde el gen reportero eGFP queda aguas abajo del gen terapéutico, aunque también queda controlado por el promotor endógeno CD40L o el constitutivo SFFV. Sólo las células transducidas con el vector constitutivo pSFFV-CD40LG-IRES-eGFP mostraron expresión superficial de la proteína, a pesar de que las células transducidas con el vector regulado bicistrónico pCD40LG-CD40LG-IRES-eGFP expresaron altos niveles de eGFP, lo que se pudo determinar por citometría de flujo. No obstante, pudimos detectar una cantidad significativa de proteína CD154 intracelular en células Jurkat activadas transducidas con el vector regulado bicistrónico. El hecho de que estas proteínas no sean transportadas eficientemente a la membrana celular es otra dificultad añadida para la el tratamiento de pacientes de HIGM1 mediante terapia génica. Para determinar si los patrones de expresión regulada de CD154 observados en células humanas transducidas con nuestras construcciones lentivirales están restringidos a los modelos humanos de HIGM1, diseñamos y construimos un vector lentiviral regulado portador del cDNA murino para CD154, Cd40lg, dirigido por un fragmento de su promotor endógeno (pCd40lg-Cd40lg), además de un vector constitutivo (pSFFV-Cd40lg). Escogimos la línea celular BW5147 CD4+ como nuestro modelo murino in vitro porque no expresa CD154 en su superficie, ni siquiera tras estimularla. Estas células fueron transducidas eficientemente con los vectores regulado y constitutivo, pero sólo aquellas transducidas con el vector regulado pCd40lg-Cd40lg fueron capaces de mostrar una expresión tejido-específica, temporal y dependiente de activación de CD154, emulando los resultados obtenidos con el vector regulado pCD40LG-CD40LG. Sin embargo, a pesar del alto número de integraciones por célula (5,9 cc) y la potente expresión de mRNA, los niveles de CD154 en la superficie de células BW5147 activadas transducidas con pCD40LG-CD40LG y la reducida subpoblación de ellas que lo expresara fue relativamente bajo (20%). Quisimos dilucidar si el grado de expresión superficial de CD154 en células transducidas iba en correlación con el número de inserciones de vector por célula. Por ello, la población positiva para CD154 obtenida tras estimular las células BW5147 transducidas con el vector regulado pCD40LG-CD40LG fue sometida a una inmunoselección celular. La expansión de las células recuperadas de dicha selección dio lugar a una población donde el número de integraciones del vector por célula ascendió a 9,7 cc y el porcentaje de células CD154+ se incrementó hasta un 48% tras su estimulación. También decidimos determinar si el CD154 expresado por las células BW5147 transducidas era funcional. En particular, el acoplamiento de CD40 con su ligando, CD40L, desencadena una cascada de señales que propicia la proliferación de células B (Spriggs et al., 1992). Pudimos verificar esta propiedad del CD154 de origen transgénico al cocultivar células BW5147 transducidas con células B purificadas de bazos de ratones sanos. Las células BW5147, tanto estimuladas como no estimuladas, transducidas con el vector constitutivo pSFFV-Cd40lg indujeron una fuerte proliferación en los linfocitos B, lo que se pudo determinar por el marcaje de éstos últimos con CFSE. Fue bastante notorio que las células BW5147 activadas transducidas con el vector regulado pCd40lg-Cd40lg desencadenaran una robusta proliferación de las células B, mientras que el cocultivo de los linfocitos B con aquellas células BW5147 transducidas con el vector regulado, pero no estimuladas no produjeron una proliferación celular superior a los niveles basales producidos por las células no transducidas. Finalmente, determinamos que la expresión de CD40L producida por el vector regulado pCd40lg-Cd40lg era tejido-específica, pues no se detectaron por citometría de flujo niveles de proteína CD154 en las células transducidas que no pertenecen al linaje hematopoyético: C2C12 (mioblastos murinos), LL2LLc (carcinoma de pulmón murino) y 293T (células embriónicas de riñón humano), a pesar de haber sido eficientemente transducidas. Por el contrario, la expresión de CD154 fue muy potente cuando estas mismas líneas fueron transducidas con el vector constitutivo. Considerando todas estas evidencias, los datos que hemos obtenido para un modelo de terapia génica de HIGM1 confirman las ventajas de optar por una estrategia que pretenda alcanzar una expresión regulada del transgén. Una estrategia que ha sido empleada con éxito anteriormente con otras PID monogénicas como WAS (Martín et al., 2005). Indudablemente hemos sido capaces de restaurar una expresión tejido-específica, dependiente de activación y regulada en el tiempo de CD154 modelos in vitro murinos (Fernández-Rubio et al., 2015) y humanos de HIGM1. No obstante, detectamos niveles relativamente bajos de CD154 en la superficie de linfocitos CD4+ transducidos con los vectores regulados. Es probable que eso se deba a interacciones entre los transcritos endógenos y transgénicos, lo que podría impedir el correcto ensamblaje de trímeros funcionales de CD154 y/o su transporte a la membrana celular (Seyama et al., 1999). Éstos son serios obstáculos que complican el desarrollo de una terapia génica para HIGM1 con aplicaciones clínicas en un fututo cercano. Deberíamos mejorar el diseño de nuestros protocolos para dotar a nuestros vectores de mejores recursos que les permitan sobreponerse a estas nuevas dificultades. Sin embargo, hemos comprobado que lograr una expresión regulada y fisiológica de un transgén para CD154, controlado por su promotor endógeno, no es una particularidad de la especie humana. Esta observación puede ser importante e interesante para el desarrollo de aplicaciones de tecnologías genéticas en otras especies donde mecanismos regulatorios estrictos sean preciso. Referencias 1. Allen, R., Armitage, RJ., Conley, ME., Rosenblatt, H., Jenkins, NA., Copeland, NG., Bedell, MA., Edelhoff, S., Disteche, CM., Simoneaux, DK., et al., 1993: CD40 ligand gene defects responsible for X-linked hyper-IgM syndrome. Science, 990-993. 2. Brown, M., Topham, DJ., Sangster, MY., Zhao, J., Flynn, KJ., Surman, SL., Woodland, DL., Doherty, PC., Farr, AG., Pattengale, PK., Brenner, MK., 1998: Thymic lymphoproliferative disease after successful correction of CD40 ligand deficiency by gene transfer in mice. Nat. Med., 4, 1253-1260. 3. 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