Caracterización funcional del transportador ABCG2 de Leishmania Major

Resum

Una gran parte de las enfermedades tropicales están ocasionadas por protozoos parásitos de la familia trypanosomatidae. Entre estas enfermedades, la leishmaniasis es la que más muertes provoca tras la malaria, por lo que se ha convertido en una prioridad para la Organización Mundial de la Salud. No existen vacunas eficaces contra esta enfermedad y solo hay un reducido arsenal de fármacos disponible; siendo necesaria la búsqueda de nuevos fármacos y nuevas dianas terapéuticas frente al parásito. Los transportadores ABC (ATP-binding cassette), implicados en funciones fisiológicas relevantes para el parásito Leishmania como el transporte de fosfolípidos, resistencia a fármacos e infectividad, podrían constituir dianas terapéuticas de interés. El genoma de Leishmania contiene 42 genes que codifican para proteínas ABC, agrupadas en 9 subfamilias (desde ABCA hasta ABCI). La subfamilia ABCG de Leishmania engloba a 6 transportadores: ABCG1-ABCG6, de los que sabemos que ABCG4, ABCG5 y ABCG6 están implicados en el tráfico de fosfolípidos y de hemo, así como en la resistencia a fármacos. En esta tesis doctoral nos hemos centrado en el estudio y caracterización funcional del transportador ABCG2 de Leishmania major, perteneciente a la subfamilia ABCG. Para el estudio funcional del transportador se obtuvieron parásitos mutantes (por cambio de una lisina por una metionina en la posición 108 del motivo Walker A del dominio de unión a nucleótidos), que expresan un fenotipo dominante negativo para ABCG2 (ABCG2K/M), y parásitos mutantes nulos para ABCG2 y su repetición en tándem ABCG1 (ABCG1+G2). Puesto que algunos de los transportadores de la subfamilia ABCG están implicados en el transporte de fosfolípidos, los cuales son esenciales para la fisiología del parásito, realizamos un ensayo de acúmulo de fosfolípidos en los parásitos dominante negativo y mutantes nulos para ABCG2. Los parásitos dominantes negativos ABCG2K/M presentan una disminución en la translocación de análogos fluorescentes de cadena corta de fosfatidilserina. Este fenotipo dominante negativo es específico para fosfatidilserina (PS), ya que el transporte de los análogos fluorescentes de fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina y esfingomielina no se vio afectado. Este mismo fenotipo se obtuvo en los parásitos mutantes nulos ABCG1+G2. Los ensayos de Anexina V-Alexa Flúor 488 demuestran que los parásitos dominantes negativos ABCG2K/M presentan una menor exposición de PS en la cara externa de la membrana plasmática en fase estacionaria de crecimiento al compararlo con los parásitos control. La PS se expone en la cara externa de la membrana plasmática de células que entran en apoptosis. El reconocimiento de la PS es la principal señal a través de la cual los cuerpos apoptóticos son reconocidos vía el receptor de PS (PSR) del macrófago. La exposición temporal de PS en la cara externa de la membrana plasmática del parásito es uno de los mecanismos empleados por las formas intracelulares (amastigotes) y promastigotes metacíclicos del parásito para infectar al macrófago y silenciar su respuesta citotóxica. En base a todos los resultados anteriores, nos propusimos estudiar la infección de macrófagos peritoneales de ratón con las diferentes líneas de parásitos: control, dominantes negativos ABCG2K/M y mutantes nulos ABCG1+G2. Los resultados muestran que los parásitos dominantes negativos ABCG2K/M y mutantes nulos ABCG1+G2 son menos infectivos que los parásitos control; por tanto, la menor expresión de PS en la superficie del parásito juega un papel relevante en el proceso de infección. Para corroborar que las diferencias en infectividad no sean debidas a alteraciones en el crecimiento y/o desarrollo de los parásitos, procedimos a la purificación de metacíclicos de parásitos controles y dominantes negativos ABCG2K/M usando la lectina de cacahuete (PNA). Observamos que no existen diferencias significativas a nivel del porcentaje de metacíclicos purificados en ambas líneas; igualmente, estos parásitos metacíclicos presentan una morfología y movilidad idéntica en ambas líneas de parásitos. Para afianzar el resultado anterior, realizamos un Western blot frente a la proteína HASPB, específica de parásitos metacíclicos y amastigotes; no observándose diferencias en la expresión de esta proteína en los parásitos controles y dominantes negativos ABCG2K/M. En el caso de los parásitos mutantes nulos ABCG1+G2, observamos que presentan un porcentaje de recuperación de metacíclicos muy inferior al obtenido con los parásitos control (salvajes) y parásitos mutantes nulos ABCG1+G2 cotransfectados con ABCG1 y ABCG2; sin embargo, la expresión de la proteína HASPB no se vio afectada. Estos datos sugieren que la eliminación del transportador, o su completa inactivación, condu- ce a un bloqueo en la maduración y/o modificaciones estructurales del lipofosfoglicano (LPG) que deben producirse en la metaciclogénesis, las cuales son necesarias para resistir la lisis del complemento en el hospedador vertebrado. Por todo lo anterior, los parásitos mutantes nulos ABCG1+G2 son aglutinados vía PNA y son más sensibles a la lisis del complemento de suero humano en la fase estacionaria de crecimiento. Hemos querido comprobar si las diferencias de infección observadas in vitro se mantenían en un modelo murino de leishmaniasis cutánea, empleando parásitos dominantes negativos ABCG2K/M y controles. Los resultados revelan que los ratones infectados con parásitos dominantes negativos ABCG2K/M presentan una reducida inflamación y no se aprecian lesiones tisulares al compararlo con los parásitos controles. En conclusión, nuestros resultados sugieren que la función de ABCG2 es necesaria para la externalización de la PS en la cara externa de los promastigotes metacíclicos, proceso necesario para la infección de macrófagos peritoneales de ratón y para el desarrollo y progresión de la enfermedad en un modelo murino de leishmaniasis.