Análisis funcional de las quinasas TOR4 y AMPK1 como reguladores de la quiescencia en trypanosoma brucei

Resumen

La Tripanosomiasis Humana Africana (HAT) o Enfermedad del sueño es causada por protozoos parásitos pertenecientes al género Trypanosoma, que son transmitidos a su hospedador a través de su vector artrópodo la mosca tse-tsé. El ciclo de vida de estos parásitos alterna entre formas altamente proliferativas y formas quiescentes, como mecanismo de adaptación al entorno de su hospedador y el mantenimiento de la infección. La transición en el desarrollo de estos parásitos responde a diversos factores, tales como la densidad celular y las condiciones propias del entorno de acogida. Estas particularidades biológicas convierten a Trypanosoma brucei en un sistema modelo excelente para estudiar las vías de señalización que rigen el desarrollo celular. Durante muchos años el único dato existente sobre el mecanismo de diferenciación de T. brucei era la existencia de un factor soluble capaz de inducir la transición hacia formas quiescentes del parásito en el torrente sanguíneo del hospedador mamífero. No obstante, tanto el mecanismo de acción o la identidad química de esta molécula aún permanecen desconocidos (Reuner, Vassella et al. 1997). En la última década se han identificado algunos de los componentes involucrados en el desarrollo de estos parásitos, cobrando importancia el estudio de aquellos que se asocian directamente a las respuestas metabólicas adaptativas (Mony and Matthews 2015). En la mayoría de los organismos, las dos proteínas que orquestan el equilibrio entre adaptación nutricional y energética son mTOR y AMPK respectivamente (Kim, Kundu et al. 2011). Las rutas de señalización de tipo mTOR en T. brucei han sido estudiadas por nuestro laboratorio con anterioridad. Así, el crecimiento de estos parásitos es coordinado a través de cuatro proteínas TbTOR distintas, que se asocian formando complejos proteicos independientes, siendo los complejos TbTORC1 y TbTORC2 los encargados de la regulación temporal y espacial del crecimiento respectivamente (Barquilla, Crespo et al. 2008, Barquilla and Navarro 2009, Barquilla and Navarro 2009). Sin embargo, a pesar de la importancia biológica de los procesos asociados a ambos complejos, no existe evidencia biológica sobre su participación en la diferenciación de T. brucei. Estudios preliminares de nuestro laboratorio, apuntaban a que otra proteína de tipo mTOR, que denominamos TbTOR4 estaba involucrada en el proceso de diferenciación. Por ello, la primera parte de esta tesis doctoral se centró en la caracterización funcional de TbTOR4 y en conocer implicación en el desarrollo del parasito. A través de espectrometría de masas, y posteriormente ensayos de co-inmunoprecipitación se demostró que TbTOR4 se une a proteínas como TbMVP-1, TbArmtor y LST8 (común en todos los complejos mTOR) para formar un nuevo complejo que denominamos TbTORC4. Por otra parte, se observó que la reducción parcial de la expresión de TbTOR4 regula la expresión de genes asociados a la diferenciación hacia formas stumpy, lo que apoya los estudios preliminares que asociaban a esta quinasa al desarrollo de quiescencia en T. brucei. Nuestros resultados ponen de manifiesto una complejidad inesperada en la señalización de mTOR, donde TbTORC4 regula negativamente la diferenciación de estos parásitos. Durante años distintos estudios han sugerido que tanto cAMP como 5¿-AMP podrían estar involucrados en la diferenciación de T. brucei. Para determinar si esto podría afectar la regulación de la ruta asociada a TbTOR4, se analizó la expresión de esta proteína tras incubar los parásitos con distintas dosis y tipos de análogos de estos nucleótidos. Así, se demostró que los productos de degradación de cAMP, y de forma más relevante el 5¿-AMP es capaz de reducir la expresión de TbTOR4 y de inducir la diferenciación de cepas monomórficas de T. brucei. Este resultado pone de manifiesto la importancia del equilibrio energético dentro del desarrollo de estos parásitos. De hecho, en la mayoría de los organismos las respuestas al desbalance ATP/AMP están mediadas por AMPK, por lo que posteriormente nos enfocamos en caracterizar los complejos AMPK en T. brucei. Análisis in silico del genoma de T. brucei, y estudios mediante espectrometría de masas y co-inmunoprecipitación de las subunidades de TbAMPK indican que en T. brucei existen dos complejos AMPK conservados a nivel estructural y funcional. Para estudiar la regulación funcional de TbAMPK se emplearon dos estrategias de activación de esta quinasa, una de ellas farmacológica, empleando un activador alostérico, y otra molecular mediante la expresión de una versión truncada catalíticamente activa de esta quinasa. Es importante destacar que ambas aproximaciones mostraron que la activación de TbAMPK¿1 induce la diferenciación hacia la forma stumpy en cepas monomórficas. Por otra parte, utilizando un modelo murino de diferenciación in vivo de cepas pleomórficas se demostró que la activación de TbAMPK¿1 ocurre durante el desarrollo hacia la forma quiescente, y que la inhibición de TbAMPK ¿1 retrasa el proceso de diferenciación en T. brucei. Finalmente, los resultados expuestos en esta tesis plantean la primera evidencia de un vínculo entre el estrés oxidativo y la actividad TbAMPK¿1 en el equilibrio de la quiescencia, proliferación y diferenciación de T. brucei. Estos datos proponen, pues, un modelo novedoso mediante el cual la homeostasis energética y la regulación mitocondrial son moduladas a través de una nueva cascada de señalización TOR4-AMPK¿1, fundamental en la biología de la transición entre proliferación y quiescencia del parásito.