Loss of HLA class I expression in prostate cancer and restoration using adenoviral and adeno-associated viral vectors

Resumen

Resumen Tesis Doctoral Título: Loss of HLA class I expression in prostate cancer and restoration using adenoviral and adeno-associated viral vectors Doctorando: Francisco Javier Carretero Coca La presente Tesis Doctoral está orientada a analizar las alteraciones de la expresión de moléculas HLA de clase I en el cáncer de próstata, así como los mecanismos moleculares implicados en dicha pérdida. Al mismo tiempo, se plantea la restauración de la expresión de HLA mediante el uso de vectores virales. La respuesta inmunológica antitumoral y el éxito de la inmunoterapia dependen del reconocimiento de la célula tumoral por parte de los linfocitos T citotóxicos (CTLs), que a su vez depende de la correcta expresión de las moléculas HLA de clase I (HLA-I) en la superficie celular de las células tumorales. Los antígenos asociados a tumor (TAA) (van der Bruggen et al., 1991) o antígenos específicos de tumor (TSA) (Mumberg et al., 1996), derivados del procesamiento intracelular de proteínas anómalas resultado de mutaciones somáticas, se unen al complejo HLA-I e inducen la activación de CTLs tras el reconocimiento con el receptor de la célula T (TCR) (Aptsiauri et al., 2007). Sin embargo, las células tumorales desarrollan con frecuencia mecanismos de escape que evitan que sean reconocidas por el sistema inmunitario, aportando una ventaja para el crecimiento y diseminación tumoral (Pawelec, 2004). Uno de los mecanismos de escape más ampliamente estudiados es la pérdida de la expresión de moléculas HLA-I, que se encuentra frecuentemente en cánceres de distinto origen histológico, y ha sido asociada con la progresión tumoral y la falta de respuesta al tratamiento (Baldi et al., 2003; Garrido et al., 1997; Mehta et al., 2008). Aunque las alteraciones en la expresión de HLA han sido estudiadas en diversos tipos de cáncer, hay algunos tumores, entre los que se incluye el cáncer de próstata, en los que todavía existe controversia en cuanto a la frecuencia de pérdida de HLA-I y en los mecanismos moleculares implicados en ella, a pesar de ser uno de los tipos de cáncer más frecuente en la población masculina. Las alteraciones de la expresión de HLA-I suele dividirse en diferentes fenotipos según el tipo de pérdida, que van desde pérdidas totales de expresión, a alteraciones parciales como la pérdida de un locus o un alelo HLA (Garrido et al., 1997). A su vez, teniendo en cuenta la naturaleza del mecanismo molecular del que se deriva la alteración, las pérdidas de HLA pueden agruparse en lesiones reversibles/regulatorias ("soft"), o lesiones irreversibles/estructurales ("hard") (Garrido et al., 2010). Las implicaciones clínicas de los defectos estructurales se consideran más serias debido a que no pueden recuperarse mediante el uso de citoquinas o tratamientos inmuno-moduladores (Aptsiauri et al., 2014). En estos casos, la terapia génica, con la introducción del gen silvestre sano mediante vectores virales, se convierte en una estrategia interesante para la recuperación de HLA (del Campo et al., 2012). En este contexto, la selección de un vector apropiado es cada vez más importante. Siendo HLA-A2 el alelo HLA-I más extendido entre la población caucásica, teniendo uno de los repertorios más amplios de péptidos asociados a tumor presentados por dicho alelo (Maecker et al., 2005; Paul et al., 2013) y habiéndose descrito su pérdida de expresión asociada a la progresión tumoral y a la resistencia a la inmunoterapia (Geertsen et al., 2002; Masuda et al., 2007; Norell et al., 2006; Serrano et al., 2000), decidimos desarrollar una estrategia basada en la terapia génica con el objetivo de incrementar o recuperar la expresión de HLA-A2 tumoral usando vectores virales. En la presente tesis se ha analizado la expresión de HLA de clase I en 48 muestras crio-preservadas de cáncer de próstata, así como los mecanismos moleculares implicados en la pérdida de su expresión. El análisis inmunohistoquímico reveló que cerca de un 90% de los tumores estudiados mostraba algún tipo de alteración en la expresión de HLA-I. Un 50% de las muestras presentaba una pérdida total de expresión de HLA-I, ya fuera con un patrón heterogéneo o un patrón totalmente negativo, mostrando una asociación con el incremento en la incidencia de recidiva tumoral, invasión perineural y alto riesgo D´Amico. El resto de tumores mostró perdidas de locus y alélicas en un 26% y un 12% respectivamente. Los análisis moleculares mostraron que la pérdida de heterocigosidad (LOH) en el cromosoma 6 (donde se localizan los genes HLA) era frecuente, detectándose en un 32% del total de muestras analizadas, mientras que sólo un tumor mostró LOH en el cromosoma 15. Los análisis de la expresión de mRNA de las muestras microdisectadas revelaron que en los tumores HLA negativos existía una reducción significativa en los niveles de Beta-2-microglobulina (ß2m), los componentes de la maquinaria de procesamiento antigénico TAP2 y tapasina, y el regulador NLRC5, y una reducción aparente de LMP2, LMP7, y el factor regulador del IFN (IRF1), en comparación con un grupo control de muestras benignas de próstata. Estos resultados apuntan a una baja-regulación coordinada de la expresión de genes HLA y APM como el principal mecanismo responsable de la pérdida de HLA, aunque una amplia proporción de los tumores estudiados también presentaba defectos estructurales en el cromosoma 6. Además, se analizaron doce líneas celulares de próstata obtenidas de pacientes que sufrían cáncer prostático que no habían sido estudiadas previamente. El análisis por citometría de flujo reveló diferentes tipos de aberraciones en la expresión de HLA-I, que van desde pérdidas alélicas o de locus, a una pérdida total de expresión en una de las líneas causada por una deleción de 480 pb en una de las copias del gen ß2m, junto a una LOH en el cromosoma 15 en la otra copia, siendo esta la primera mutación en ß2m descrita en cáncer de próstata. El uso de líneas celulares cancerígenas facilita el estudio de las alteraciones de HLA, así como permite la manipulación de diferentes factores implicados en su expresión, modulando e incluso recuperando la expresión de HLA-I. En la segunda parte de la tesis, analizamos la eficiencia de transfección de diferentes serotipos de vectores adeno-asociados (AAV) y un adenovirus portando el gen de la proteína verde fluorescente (GFP) en diversas líneas celulares cancerosas de diferente origen histológico. Los resultados obtenidos confirmaron que el vector adenoviral ofrece una mayor transducción del trasgén, seguido por el AAV serotipo 2 (AAV2). Además, se construyeron dos nuevos vectores recombinantes: un vector adenoviral y un AAV2, portando ambos el gen HLA-A2, con los que conseguimos transferir el gen de forma eficiente en células tumorales. Usando estos vectores fuimos capaces de: 1) Recuperar la expresión de HLA-A2 en una línea celular que había perdido previamente A2 debido a una pérdida de haplotipo; 2) Incrementar la expresión de HLA-A2 en células con bajo nivel de expresión; 3) Introducir HLA-A2 como un alelo adicional en células con un genotipo no HLA-A2. Además, la co-transfección de HLA-A2 y ß2m usando vectores adenovirales en líneas totalmente negativas para HLA-I, demostró la expresión completa del complejo HLA-A2/ß2m en la superficie celular, dando opción a corregir simultáneamente múltiples alteraciones estructurales que causen pérdida de la expresión de HLA-I. La alta incidencia de pérdidas de HLA-I observada en cáncer de próstata, causadas tanto por defectos regulatorios como por defectos estructurales, parece estar asociados con la progresión de la enfermedad y puede resultar un impedimento para la mejora de la salud del paciente, favoreciendo la progresión tumoral y la resistencia a las inmunoterapias basadas en CTLs. Podríamos especular que las aberraciones genéticas/estructurales se acumulan de forma continua durante la progresión tumoral, generando variantes con baja inmunogenicidad que escapan del control inmunológico. Nuestros resultados sugieren que una inmunoterapia eficaz se beneficiaría de un tratamiento complementario basado en la terapia génica para eludir la selección y el crecimiento de células tumorales HLA-I negativas. La recuperación de una especificidad endógena de HLA-I perdida podría ser beneficiosa en la restauración de la expresión natural de HLA-I responsable de la presentación del antígeno, y así incrementar el rechazo tumoral por parte de los CTLs. Nuestros hallazgos indican que los vectores virales que codifican moléculas HLA pueden representar una herramienta conveniente para la re-expresión de HLA-I en células tumorales, incrementado el rechazo de tumores que albergan defectos genéticos/estructurales responsables de la pérdida de HLA-I. La regulación positiva de HLA-I podría permitirnos entender mejor como desarrollar una respuesta inmunitaria específica mediada por CTLs y mejorar la respuesta terapéutica de la inmunoterapia frente al cáncer. Bibliografía Aptsiauri, N., T. Cabrera, A. Garcia-Lora, M. A. Lopez-Nevot, F. Ruiz-Cabello, and F. Garrido, 2007, MHC class I antigens and immune surveillance in transformed cells: Int Rev Cytol, v. 256, p. 139-89. Aptsiauri, N., A. M. 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