The determination of causal genetic variants involves vitamin D genes CYP27B1 and VDR, and the innate antiviral response gene SP140, in multiple sclerosis

Resumen

Antecedentes La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad autoinmune que afecta al sistema nervioso central (SNC): el cerebro y la médula espinal, y que cursa principalmente con desmielinización neuronal. Como consecuencia, la capacidad de los nervios de transmitir los impulsos eléctricos desde el cerebro y al cerebro se interrumpe y produce la aparición de los diferentes síntomas que aparecen y remiten, denominados ¿brotes¿, o que progresan lentamente a lo largo del tiempo. La Esclerosis Múltiple, como enfermedad compleja, está caracterizada por una moderada heredabilidad y por la interacción de factores genéticos y ambientales. La variabilidad genética es un determinante importante en la susceptibilidad y progresión de la Esclerosis Múltiple. Recientemente han surgido nuevo tipo de estudios: los Estudios de Asociación del Genoma Completo (GWAS) que se basan en el análisis de variantes a lo largo de todo el genoma en grandes poblaciones y sin una hipótesis establecida. De este modo se buscan loci asociados a la enfermedad sin establecer una determinada función en la patología de la misma. Por medio de los GWAS se han determinado alrededor de 100 loci asociados a la susceptibilidad a padecer EM aunque en su mayoría se desconoce el gen causal de esta asociación y el efecto de la variante génica sobre la función de este gen que en último término es la causa de la asociación genética. Objetivo El principal objetivo de este trabajo es la determinación de las variantes causales de los loci asociados con la EM por estudios GWAS y revelar, por el análisis del efecto funcional de la variante causal, los genes implicados y su efecto en la enfermedad. Metodología En este trabajo hemos estudiado 4 loci que se han visto asociados a EM. Hemos analizado la correlación de los niveles de expresión de los distintos genes de los loci con las variantes de la región asociadas con EM. Para ello hemos empleado datos de expresión procedente de RNA-Seq de líneas linfoblastoides de población europea del proyecto GEUVADIS y GTEx y análisis de expresión por sistemas de cuantificación por PCR a tiempo real con muestras de RNA de monocitos, con distintos tratamientos, de 109 individuos recogidos en el Biobanco de Andalucía. Hemos hechos estudios funcionales para identificar las variantes que afectan el splacing de genes y que se asocian con la enfermedad y hemos hecho estudios caso-control en una cohorte española de 4000 enfermos y 4000 controles para validar la asociación con la enfermedad de las variantes funcionales identificadas aquí frente a las descritas por el GWAS. Resultados La expresión del gen CYP27B1, enzima activadora de la vitamina D, en monocitos activados con LPS y IFN¿ correlaciona con los genotipos del SNP rs10877013 que es la variante causal de la asociación con MS ene el locus 12q13-14. Esta correlación no se observa en otro tipo celular como es las células LCLs en las que no se produce activación de la expresión del gen con LPS y IFN¿ o vitamina D. La expresión del gen VDR, receptor de la vitamina D, que se localiza a 10Mb del gen CYP27B1SNP también correlaciona con la variante rs10877013 en células LCL tratadas con vitamina D. En ambos casos el alelo de riesgo a EM se asocia con una baja expresión de los genes. La variante rs2248359 que se ha visto asociada con EM en el locus 20q13.2 se localiza a 1 Kbp del gen CYP24A1, enzima que degrada la vitamina D. Hemos determinado que este gen se expresa de forma inducible tras la activación con la forma activa de la vitamina D (25(OH)2D), sin embargo no detectamos una correlación entre los niveles de expresión de este gen y los genotipos de la variante asociada a EM ni con otra localizada en la región. Nuestros resultados indican que la desregulación en el splicing del gen SP140 es la causa de la asociación genética del locus 2q37.1 con EM. El alelo T del SNP rs28445040 que se asocia con aumento de riesgo de EM correlaciona con la aparición de un transcrito que no lleva el exón 7 y con una disminución del transcrito completo. La variante rs28445040 se localiza en el exón 7 y por análisis de minigén hemos demostrado que es la causa del splicing alternativo del exón 7. Con estudios caso-control en una cohorte española de 4000 pacientes de EM y 4000 controles hemos confirmado que este SNP se asocia a la enfermedad y apunta a que es la variante causal de la asociación. Mediante estudios de colocalización de las variantes que se asocian a cambios de expresión de genes (expression quantitative trait loci (eQTLs)) obtenidas del proyecto GEUVADIS y las variantes que se asocian a EM en el estudio de mapeo fino IMMUNOCHIP observamos que ambos efectos confluyen en un grupo de variantes en total LD en el locus 12p13.31. Estos resultados apuntan a que la variante rs3764022, que produce un splicing alternativo del gen CLEC2D es la causa de la asociación con MS. Sin embargo, estudios de colocalización de las eQTLs de GEUVADIS con los datos de asociación del GWAS con 10000 pacientes y 30000 controles, indican que la variante causal correlaciona con cambios del gen CLECL1. El estudio caso-control entre las variantes mejor asociadas en el IMMUNOCHIP y en el GWAS en nuestra cohorte española mostró que ninguna de las dos variantes se asocia con EM en la población española. Conclusiones El estudio de la correlación entre las variantes que se asocian con EM y aquellas que se asocian con cambios de expresión de genes en las mismas regiones nos ha permitido determinar que los cambios en la expresión de los genes CYP27B1, VDR y SP140 son la causa de la asociación de los loci con la EM. Por otra parte, hemos observado que el sistema tiene limitaciones a la hora de determinar los genes causales como son la expresión tejido o condición específicos, que nos ha llevado a buscar sistemas en los que se exprese el efecto de la variante como es el caso del gen CYP27B1 o VDR que se manifiesta únicamente en condiciones de activación concretas. Esta metodología se está aplicando en otras enfermedades complejas lo que está permitiendo determinar los genes que están detrás de las asociaciones genéticas.