Mecanismos moleculares de la actividad antiinflamatoria de la melatoninaparticipación del receptor nuclear roralfa

Resum

La insuficiencia cardiaca es uno de los componentes más importante del fallo multiorgánico que se produce durante la sepsis. Esta patología se asocia con una alta tasa de mortalidad y morbilidad en la unidad de cuidados intensivos de los hospitales, siendo su incidencia y susceptibilidad desproporcionadamente elevadas en los pacientes con edades avanzadas. Hoy en día se sabe que el envejecimiento se acompaña de una activación en la respuesta inmune que promueve el establecimiento de un estado inflamatorio crónico de bajo grado conocido con el término de inflammaging. Esta condición asociada a la edad, agrava significativamente el pronóstico de las personas mayores a la sepsis y nos ayuda a entender por qué los modelos animales envejecidos son más sensibles a los efectos letales de esta patología. Debido a que la sepsis constituye un cuadro clínico específico y que actualmente no existe ninguna terapia eficaz, es de suma importancia comprender la desregulación que tiene lugar en la respuesta inmune innata durante el envejecimiento, para poder entender mejor lo que ocurre durante la sepsis en organismos envejecidos. Estudios previos han demostrado la importancia que tiene el factor nuclear kappaB (NF-κB) durante el proceso de envejecimiento y en la fisiopatología de la sepsis; en este sentido, el reconocimiento de la señal inflamatoria por sus receptores específicos inicia una cascada de señalización que finaliza en la translocación nuclear y posterior activación transcripcional de NF-κB. En consecuencia, se induce la expresión de numerosos genes, incluidos citoquinas y enzimas de carácter pro-inflamatorio, inmunoreceptores o moléculas de adhesión. Asimismo, esta condición inflamatoria se asocia con una profunda disfunción mitocondrial y consecuente apoptosis, lo que favorece la liberación de especies reactivas de oxígeno (ROS), ATP y DNA mitocondrial (mtDNA) al citosol. Tras su liberación, estas señales asociadas al daño celular serán reconocidas por el inflamasoma NLPR3, un complejo multiproteíco que participa en la activación de la caspasa-1 y, en consecuencia, en la producción de las formas maduras de las citoquinas pro-inflamatorias, incluida IL-1β. Así, la activación paralela de las vías de la inmunidad innata dependientes de NF-κB y del inflamasoma NLRP3, conduce a una sobreproducción de IL-1β, TNFα y otros mediadores pro-inflamatorios, los cuales se encuentran significativamente elevados durante el proceso inflamatorio asociado a la edad y a la sepsis. Por otro lado, estudios previos han demostrado que las alteraciones que tienen lugar en la expresión de los genes reloj durante el envejecimiento se asocian al estado de inflammaging, a través de la caída en los niveles de NAD+ y a la reducción en la actividad deacetilasa de SIRT1, lo que impide la inactivación de NF-κB. Por tanto, el proceso séptico debería incrementar la cronodisrupción que se da con la edad, exacerbando la respuesta inflamatoria y el daño asociado. La falta de una estrategia terapéutica eficaz contra la sepsis puede deberse a la existencia de la vía de la inmunidad innata dependiente de la conexión mitocondria/inflamasoma NLRP3, además de la vía clásica dependiente de NF-κB. Por tanto, para modular el proceso séptico se necesita de un medicamento capaz de atenuar todo el bucle de la inmunidad innata representado por la conexión entre los genes reloj/NF-κB/NLRP3, y que evite al mismo tiempo la producción de ROS de origen mitocondrial. La melatonina (N-acetil-5-metoxitriptamina) cumple totalmente estos criterios; es un potente antioxidante y depurador de radicales libres; se acumula en la mitocondria a altas concentraciones, donde mantiene su homeostasis; muestra potentes propiedades antisépticas, modulando la vía de activación de la inmunidad innata dependiente de NF-κB. Asimismo, recientemente hemos demostrado que la melatonina también es capaz de inhibir la activación del inflamasoma NLRP3 durante la sepsis. De acuerdo con estos antecedentes, hemos estudiado en el corazón de ratones envejecidos el papel del inflamasoma NLRP3 en el establecimiento del inflammaging y durante la respuesta inmunitaria exacerbada que se da en la sepsis, evaluando al mismo tiempo, los mecanismos moleculares involucrados en la acción anti-inflamatoria de la melatonina. Para ello, los objetivos de este trabajo fueron: 1) Evaluar en ratones C57BL/6 de 18 meses de edad, controles y con sepsis, la activación del inflamasoma NLRP3 mediante el análisis de la expresión y contenido de sus principales componentes (NLRP3 y ASC), activación de la caspasa-1 y maduración de la IL-1β, comparando estos parámetros con ratones controles C57BL/6 de 3 meses de edad. 2) Estudiar en ratones C57BL/6 de 18 meses de edad, controles y con sepsis, la activación de NF-κB mediante su presencia en el núcleo, unión al DNA y niveles de expresión y contenido proteico de marcadores pro-inflamatorios. Comparar estos parámetros con ratones controles C57BL/6 de 3 meses de edad. 3) Estudiar en ratones C57BL/6 de 18 meses de edad, controles y con sepsis, el estado de los genes reloj, la expresión y actividad de los principales enzimas antioxidantes, así como la función mitocondrial a través del análisis en la actividad de los complejos respiratorios, y la vía apoptótica intrínseca. Comparar con ratones controles C57BL/6 de 3 meses de edad. 4) Evaluar los efectos protectores del tratamiento agudo con melatonina sobre todos los parámetros mencionados anteriormente, así como sus posibles mecanismos de acción y dianas moleculares, en ratones sépticos C57BL/6 de 18 meses de edad. Los resultados mostrados en esta tesis doctoral ayudan a comprender mejor los mecanismos que subyacen durante el proceso de inflammaging, confirmando que la edad produce, en primer lugar, una disrupción del bucle Clock/Bmal1/SIRT1/NF-κB, una activación secundaria de la respuesta inmune dependiente de NF-κB, con el consiguiente deterioro mitocondrial y estrés oxidativo asociado, que finalmente termina con la activación del inflamasoma NLRP3, la amplificación de la respuesta inflamatoria y, en última instancia, la activación de los procesos apoptóticos y la pérdida de la capacidad funcional de la célula. A la vista de estos resultados, proponemos el término chronoinflammaging, como el proceso asociado al envejecimiento responsable del estado inflamatorio subclínico observado en los ratones de edad avanzada. Por su parte, la sepsis incrementó aún más las alteraciones observadas durante el inflammaging, produciendo una respuesta inflamatoria desproporcionada en el corazón de los ratones envejecidos. Por tanto, el estado pro-inflamatorio de bajo grado asociado al proceso de envejecimiento contribuye a la elevada susceptibilidad y mortalidad de las personas mayores frente a la sepsis. Nuestros datos también demuestran que la administración de melatonina contrarresta totalmente la respuesta a la sepsis, reduciendo la inflamación, el estrés oxidativo, y la disfunción mitocondrial hasta los niveles mostrados por los ratones envejecidos no sépticos. Sin embargo, esta terapia no contrarresta el efecto del inflammaging, evidenciando una importante dualidad en los efectos de la melatonina; por un lado, dosis bajas administradas de forma crónica previenen el estado inflamatorio de bajo grado asociado a la edad, y por otro, dosis altas administradas de forma aguda contrarrestan el proceso inflamatorio asociado a la sepsis, sin afectar al estado inflamatorio basal de los ratones envejecidos. En conjunto, nuestros resultados sugieren al chronoinflammaging como la base molecular y bioquímica del proceso de envejecimiento, e identifican al inflamasoma NLRP3 como una nueva diana molecular de la melatonina durante la sepsis en ratones de edad avanzada, proporcionando una justificación para su uso terapéutico en enfermedades inflamatorias dependientes del inflamasoma NLRP3.