El pez cebra como modelo de Parkinson. Evaluación de la disfunción mitocondrial y de la capacidad terapéutica de la melatonina

Resumen

La enfermedad de Parkinson es una enfermedad neurodegenerativa, la segunda con mayor incidencia tras el Alzheimer, cuyos síntomas más frecuentes son la rigidez, la bradiquinesia y el temblor en reposo. Estos síntomas aparecen como consecuencia de la muerte neuronal en una zona muy concreta del cerebro, la pars compacta de la sustancia negra. El resultado de la muerte de neuronas dopaminérgicas en esta zona es una disminución en la cantidad de dopamina que alcanza el estriado, lo que da lugar a una alteración entre las múltiples conexiones establecidas entre los diferentes ganglios basales, siendo la consecuencia final una mayor inhibición sobre el tálamo, que junto con la corteza motora y el cerebelo, regulan la actividad motora. Esta alteración provoca una desregulación en el control del movimiento voluntario, dando lugar a los síntomas motores característicos de la enfermedad. El 90-95% de los casos de Parkinson son de causa desconocida, se habla por tanto de Parkinson idiopático, mientras que solo 5-10% están asociados a factores genéticos, en este caso se habla de Parkinson familiar. En ambos casos la muerte neuronal está asociada a la disfunción mitocondrial, estando esta condicionada por procesos fisiopatológicos comunes en la enfermedad de Parkinson como son el estrés oxidativo/nitrosativo y la inhibición del complejo I mitocondrial. El aumento de especies reactivas de oxígeno y de nitrógeno contribuyen al daño mitocondrial que, junto con el fallo bioenergético provocado por la inhibición del complejo I, conducen a la apertura del poro de transición mitocondrial, con la consiguiente salida de citocromo c y la inducción de la apoptosis. El Parkinson familiar está asociado a mutaciones en genes cuyos productos son proteínas relacionadas con el mantenimiento de la función y homeostasis mitocondriales. Los principales genes relacionados con casos de Parkinson familiar son PINK1, Parkina, DJ-1 y α-sinucleína. PINK1 es una ubiquitin quinasa que detecta y se une a mitocondrias dañadas. En esta posición es capaz de fosforilar a Parkina, una ubiquitin E3 ligasa, que una vez activa por PINK1 y reclutada a la mitocondria inicia procesos de mitofagia para eliminar a las mitocondrias dañadas. DJ-1 puede interaccionar con parkina y PINK1, pero sobre todo tiene funciones antioxidantes, regulando la expresión de genes antioxidantes y de la tiroxina hidroxilasa, enzima involucrada en la ruta de biosíntesis de la dopamina. Por lo tanto, los tres genes participan en una vía común relacionada con el mantenimiento de la homeostasis mitocondrial. Recientemente, se ha identificado otro gen, MUL1, que codifica una E3 ligasa mitocondrial y que puede contrarrestar los fenotipos mutantes de PINK1/Parkina, al intervenir junto con parkina en la ubiquitinización de Mfn. Finalmente, la α-sinucleína, que es el principal componente de los cuerpos de Lewy, inclusiones citoplasmáticas características de esta enfermedad y que aparecen en las neuronas dopaminérgicas, constituye una parte importante de la fisiopatología de la disfunción mitocondrial. El pez cebra se presenta como un modelo en auge para el estudio de la enfermedad de Parkinson, al tratarse de un animal vertebrado, cuyo sistema dopaminérgico está bien caracterizado, donde las neuronas dopaminérgicas se localizan en el diencéfalo ventral, bulbo olfatorio y núcleo coeruleus, por tanto una disposición diferente pero con un sistema nigroestrial comparable al de humanos. Además el pez cebra es sensible al MPTP, neurotoxina utilizada que induce las principales características de la enfermedad de Parkinson afectando primariamente a la mitocondria, y permite analizar la función mitocondrial in vivo, siendo este aspecto determinante para el estudio de la fisiopatología parkinsoniana. Por último, todos los genes, comentados anteriormente y cuyas mutaciones afectan a la homeostasis mitocondrial, están también presentes en el cerebro del pez cebra, excepto la α-sinucleína. En su lugar el pez cebra contiene tres genes, sncb, sncga y sncgb que expresan las isoformas β-, γ1- y γ2-sinucleínas, respectivamente. La γ1-sinucleína es una proteína abundantemente expresada en cerebro del pez cebra, y su función podría ser similar a la humana, interviniendo en funciones dopaminérgicas. La melatonina es una indolamina altamente conservada que también está presente en el pez cebra. Debido a sus capacidades antioxidantes y antiinflamatorias, la melatonina mantiene la homeostasis mitocondrial en diferentes patologías debidas a alteraciones mitocondriales, incluyendo diferentes modelos de parkinsonismo. Estos datos hacen pensar en que esta indolamina podría tener un efecto protector frente al desarrollo de la enfermedad de Parkinson, aunque no existe información con respecto a si es capaz de recuperar el estado parkinsoniano una vez establecido, ni sobre si sus efectos protectores están relacionados con la regulación de la expresión de los genes implicados en la homeostasis mitocondrial anteriormente comentados. El tratamiento actual de la enfermedad de Parkinson, es puramente sintomático, por lo que el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas que frenen el avance de la enfermedad serían de gran interés clínico. De acuerdo con estos precedentes, y para mejorar la compresión de los mecanismos moleculares implicados en la disfunción mitocondrial en la enfermedad de Parkinson, en el presente estudio hemos analizado desde un punto de vista bioquímico, molecular, genético y fenotípico el modelo parkinsoniano de pez cebra tratado con MPTP. Además, se ha estudiado el posible efecto neuroprotector de la melatonina en este modelo parkinsoniano, evaluando la capacidad de prevención y curación de la administración de esta indolamina mediante una evaluación molecular, genética y fenotípica. Los resultados de esta tesis muestran que los embriones de pez cebra tratados con MPTP a una dosis de 600 μM durante dos días, desarrollan todas las alteraciones fisiopatológicas características de la enfermedad de Parkinson. El MPTP induce, en los embriones de pez cebra, una inhibición de la actividad del complejo I similar a la registrada en el cerebro de pacientes con la enfermedad, y acompañada por un aumento del estrés oxidativo, caracterizado por un aumento del ratio GSSG/GSH y por una disminución de la actividad de las principales enzimas antioxidantes, SOD, GPx y GRd, y una aumento del estrés nitrosativo, caracterizado por un aumento de la iNOS. El análisis de la respiración mitocondrial in vivo, pone de manifiesto el fallo bioenergético existente, caracterizado por una disminución en la producción de ATP y un aumento del escape de protones, lo que conduce a la muerte de las neuronas dopaminérgicas localizadas en el diencéfalo ventral y el bulbo olfatorio, coincidiendo con las zonas donde hemos registrado una mayor inducción de iNOS. En este modelo parkinsoniano de pez cebra, el análisis molecular de los genes implicados en la función mitocondrial, PINK1, Parkina, DJ-1, MUL1 y γ1-sinucleína, muestra que el tratamiento con MPTP produce alteraciones en la expresión de estos genes. Estas alteraciones conducen a la ausencia de las proteínas parkina y DJ-1, lo que impide que estas lleven a cabo la inducción de mitofagia y el control del estrés oxidativo, respectivamente, y que MUL1 sea incapaz de compensar la ausencia de parkina. Todas estas alteraciones contribuyen a la disfunción mitocondrial y a mantener un pool de mitocondrias dañadas en la célula, que a su vez seguirán contribuyendo en aumentar el estrés oxidativo/nitrosativo y conduciendo finalmente a la muerte neuronal. Estos cambios moleculares se manifiestan fenotípicamente con una disminución de la actividad locomotora en los embriones de pez cebra. Ante esta situación de disfunción mitocondrial y muerte neuronal, el tratamiento con melatonina tiene un potente efecto neuroprotector. Esto efecto se debe a que la mitocondria es diana celular de la melatonina, donde gracias a sus propiedades disminuye el estrés oxidativo, normalizando el índice GSSG/GSH y potenciando la actividad de las enzimas antioxidantes antes mencionadas. También tiene un potente efecto antiinflamatorio inhibiendo la iNOS. Todas estas acciones suponen una mejora de la función mitocondrial, con un aumento de la actividad del complejo I mitocondrial y, como muestran los análisis in vivo, con un aumento de la producción de ATP y una disminución del escape de protones. Por todo ello, la melatonina es capaz de evitar el fracaso bioenergético y por lo tanto la muerte neuronal dopaminérgica en las zonas del diencéfalo ventral y el bulbo olfatorio que están significativamente afectadas por el MPTP. Pero quizás, lo más interesante de todo es que la melatonina tiene este mismo efecto una vez que el estado parkinsoniano se ha establecido, es decir su efecto no es sólo preventivo sino que tiene efecto curativo. Por último, demostramos por primera vez que, los efectos beneficiosos de la melatonina sobre la función mitocondrial también se deben a que esta indolamina modifica la expresión de los genes relacionados con el mantenimiento de la homeostasis mitocondrial alterados por el MPTP. El tratamiento con melatonina aumenta la expresión de parkina, permitiendo que esta sea fosforilada por PINK1, reclutada a la mitocondria e induciendo la mitofagia para eliminar las mitocondrias dañadas. También aumenta la expresión de PINK1, DJ-1 y MUL1, favoreciendo un correcto funcionamiento mitocondrial y protegiendo a las neuronas de la muerte. Todos estos efectos se ven reflejados fenotípicamente en una recuperación de la actividad locomotora. En conjunto, nuestros resultados sugieren que el daño mitocondrial en la enfermedad de Parkinson está determinado por diferentes eventos fisiopatológicos, estrés oxidativo, neuroinflamación, inhibición del complejo I y alteración de genes relacionados con el mantenimiento de la calidad mitocondrial, y que todos ellos confluyen en la disfunción mitocondrial que provoca la muerte neuronal. Ante esta situación, la melatonina se presenta como una estrategia farmacológica a tener en cuenta, puesto que actúa a nivel de todos y cada uno de estos eventos patofisiológicos.