Pseudomonas putida como plataforma para la producción de bioproductos

Resumen

El agotamiento de los combustibles fósiles sumado en la inestabilidad de los precios hace que aumente el interés por los combustibles renovables. El butanol, puede ser un aditivo de la gasolina debido a su contenido energético además de ser ampliamente empleado en la industria como precursor de pinturas, aromatizante y precursor de plásticos y polímeros. Por otra parte, los mecanismos de tolerancia y asimilación han sido ampliamente estudiados en Pseudomonas putida. Debido a las características naturales de P. putida, se estudió el diseño una cepa huésped para la producción de butanol así como explorar las posibles rutas para su producción mediante el uso de operones sintéticos. Este trabajo se centró en los estudios de tolerancia y asimilación de butanol en P. putida BIRD-1, una bacteria promotora del crecimiento vegetal, en la cual se estudiaron los mecanismos responsables en la asimilación del butanol como fuente de carbono y la respuesta fisiológica frente a este disolvente. El estudio de la ruta de asimilación seguido de la construcción de la cepa que no asimila butanol, conducen hacia el uso de este huésped tolerante a butanol de modo natural, como posible plataforma para la síntesis de butanol. En este trabajo se evaluó el uso de diferentes cepas para dicho proprósito; P. putida KT2440, DOT-T1E y BIRD-1. Además se identificaron los genes implicados en tolerancia y asimilación mediante diversas técnicas y se exploraron posibles rutas para la síntesis de butanol. Llegando a las siguientes conclusiones: I) Pseudomonas putida BIRD-1 fue capaz de soportar concentraciones de butanol mayores que KT2440 DOT-T1E. Debido a su gran versatilidad en la utilización de fuentes de carbono, un consumo de butanol limitado y la mayor tolerancia a butanol, se consideró que BIRD-1 es un modelo de estudio adecuado para la producción de butanol. II) Se identificaron 16 mutantes (con mutaciones en 14 genes distintos) que mostraban deficiencias en la tolerancia a butanol, su asimilación o ambos. Tres de los mutantes eran deficientes en la asimilación de butanol, otros tenían defectos en la tolerancia y los diez restantes eran mutantes en ambos, tolerancia y asimilación. III) Los tres mutantes deficientes en asimilación de butanol presentaban inserciones en diferentes posiciones dentro del gen que codifica la malato sintasa B (GlcB), una enzima clave de la ruta del glioxilato (metabolismo energético). IV) Los mutantes sensibles a disolventes presentaban inserciones que interrumpían genes relacionados con la generación de energía y el funcionamiento del ciclo de Krebs. Uno de los mutantes presentó una inserción del transposón en el gen lpdG, que codifica el componente E3 dihidrolipoamida deshidrogenasa del complejo α-cetoglutarato deshidrogenasa; mientras que en los otros dos mutantes, el transposón mini-Tn5 se insertó en sucA y sucD, dos genes que codifican los componentes del complejo 2-oxoglutarato deshidrogenasa dependiente de tiamina. V) La utilización de técnicas -ómicas nos permitió identificar los genes esenciales relacionados con la tolerancia y la asimilación de butanol. Se identificó la ruta de asimilación butanol en Pseudomonas putida BIRD-1. Un control exhaustivo del metabolismo energético, las bombas de eflujo y la presencia de cofactores permite tolerar butanol. VI) Una segunda ronda de mutagénesis usando el mutante glcB como cepa parental permitió aislar un doble mutante incapaz consumir butanol. Este mutante presentaba una inserción en PPUBIRD1_2034, un gen que codifica el elemento sensor de una histidina quinasa. VII) El contexto genético de este sensor histidina quinasa reveló la presencia de un conjunto de genes potencialmente implicados en la asimilación de butanol. Por ejemplo, acil-CoA sintetasas, acil-CoA deshidrogenasas y enoil-CoA hidratasas que permiten la entrada del esqueleto carbonado del butanol en el metabolismo central cuando el ciclo del glioxilato está interrumpido.