Búsqueda de inhibidores de la interacción entre los dominios L víricos y sus dianas celulares de interés como antivirales de amplio espectro

Resumen

Los virus son uno de los principales causantes de enfermedades a nivel mundial. Los tratamientos actuales se centran en la inactivación directa de las proteínas víricas, propiciando la aparición de resistencias. Este contexto evidencia la necesidad de desarrollar nuevos antivirales, principalmente para los virus encapsulados que causan epidemias letales de fiebres hemorrágicas (Ébola, Marburgo). El mecanismo de egresado celular (proliferación) de estos virus se basa en la interacción de sus dominios L PPxY con el tercer dominio WW de la ligasa humana Nedd4-1, hNedd4-WW3. Este dominio se considera una diana muy atractiva para el desarrollo de antivirales que no promoverían la aparición de cepas resistentes. El trabajo desarrollado en esta Tesis ha tenido como primer objetivo el estudio de las preferencias de unión de hNedd4-WW3 mediante la selección competitiva de bibliotecas peptídicas co-expresadas en fagos (phage display). Los determinantes de alta afinidad que hemos identificado se han conjugado para diseñar dos secuencias que mejoran significativamente los ligandos descritos hasta la fecha en términos de afinidad por hNedd4-WW3 (Kd = 150 nM) en un orden de magnitud y de entalpía de unión a hNedd4-WW3 (- 95 kJ/mol) en 20 kJ/mol. Además, las pruebas biológicas realizadas con el péptido WW3-PD-2-Tat-d nos han confirmado la capacidad de estos péptidos de afinidad nanomolar para bloquear específicamente el egresado celular de partículas víricas de la proteína VP40 del virus del Ébola (eVP40), del Marburgo (mVP40) y también para bloquear la infección del virus recombinante VSV-M. Dado que el bloqueo con fármacos de las interacciones de los dominios L víricos PPxY tiene como potencial inconveniente la toxicidad asociada a defectos funcionales de la ligasa humana Nedd4-1, el segundo objetivo del trabajo desarrollado en esta Tesis se ha centrado en estudiar las preferencias de unión de cada uno de los cuatro dominios WW de hNedd4. Para conseguir este objetivo, en primer lugar hemos obtenido un perfil de especificidad para cada uno de los cuatro dominios WW de Nedd4-1 mediante phage display. Posteriormente, hemos realizado un análisis de la unión de todos los motivos PPxY del proteoma humano a los mismos cuatro dominios WW. En tercer lugar, hemos obtenido un perfil de especificidad con las veinte mejores secuencias que prefiere cada uno de estos dominios WW y los hemos contrastado con los obtenidos por phage display. Los perfiles de especificidad obtenidos con ambos repertorios de secuencias son congruentes entre sí. Para confirmar la relevancia de nuestros resultados, seleccionamos un conjunto de péptidos representativos de las secuencias obtenidas por phage display y las secuencias naturales. La caracterización de la interacción de estos ligandos con cada uno de los dominios WW objeto de estudio mediante espectroscopía de fluorescencia e ITC nos ha confirmado que las principales diferencias entre las secuencias naturales y las secuencias obtenidas por phage display se localizan en las posiciones de la región C-terminal. Además, nuestros resultados señalan que las secuencias con el motivo LFP en la región C-terminal (obtenidas exclusivamente por phage display) superan a los ligandos naturales de hNedd4 en términos de afinidad por hNedd4-WW3 y de especificidad por hNedd4-WW3 frente al resto de dominios WW de Nedd4-1. No obstante, el comportamiento in vivo de los péptidos lineales (baja internalización celular, escasa estabilidad metabólica) plantea la necesidad de buscar moléculas con mejores propiedades farmacocinéticas. En este sentido, el tercer objetivo del trabajo desarrollado en esta Tesis se ha centrado en la puesta a punto de un sistema reverso de doble híbrido bacteriano (RTHS) para la selección in vivo de bibliotecas de péptidos cíclicos genéticamente codificadas (SICLOPPS) que bloqueen la interacción de hNedd4-WW3 con la proteína eVP40. Los resultados de este trabajo señalan que la topología relativamente plana de la superficie de interacción entre ambas proteínas podría dificultar el bloqueo de este tipo de interacciones con péptidos cíclicos de pequeño tamaño. Como complemento al trabajo realizado para la identificación de inhibidores peptídicos, establecimos como el último de los objetivos de esta Tesis la puesta a punto de un ensayo que permitiría el cribado en células humanas de bibliotecas de productos naturales de origen microbiano para identificar inhibidores de la gemación vírica de la proteína eVP40 y de la proteína Gag del SIDA. En este caso, nuestros resultados demuestran que hemos avanzado en la puesta a punto y la automatización del ensayo.