Optimización de distintos portainjertos en el cultivo del pistachoun enfoque fisiológico y molecular

Resumen

OPTIMIZACIÓN DE DISTINTOS PORTAINJERTOS EN EL CULTIVO DEL PISTACHO: UN ENFOQUE FISIOLÓGICO Y MOLECULAR. Resumen para su inclusión en la base de datos de tesis doctorales (TESEO) presentado por la licenciada Dña. Cristina Aznarte Mellado Con el V. B. del Director: Dr. Rafael Navajas Pérez Granada, 2015 Introducción El género Pistacia perteneciente a la familia Anacardiaceae se compone de una docena de especies arbóreas caducas, dioicas y con polinización anemófila. Aunque algunas de ellas son utilizadas en la producción de aceites, jabones y cosméticos debido a su alto contenido oleico, la especie más relevante desde el punto de vista comercial es P. vera (conocida comúnmente como pistachero o alfóncigo) por la producción de semillas comestibles o pistachos. No en vano, esta especie se encuentra sexta en el ranking de la producción mundial de frutos secos, por detrás de la almendra, la nuez, el anacardo, la avellana y la castaña. El cultivo del pistachero, como el de tantos otros frutales, requiere de la presencia de un patrón o portainjertos, ya que en lugares donde no crece naturalmente, su germinación y capacidad de enraizamiento son muy limitadas. Dentro del género Pistacia encontramos un importante número de especies que pueden ser usadas como portainjertos, las más empleadas son P. atlantica Desf., P. terebinthus L., así como los híbridos interespecíficos PGII y UCB-1. Sin embargo, no se ha llegado a un consenso universal acerca de qué portainjertos utilizar, posiblemente porque la eficacia de cada uno de ellos varía notablemente en función de la zona de cultivo. La influencia que ejerce la elección del portainjertos en la productividad final del cultivo, ha sido analizada en varias publicaciones científicas. Esta interacción se traduce en una mayor tolerancia a situaciones de extrema salinidad (Walker et al., 1987; Behoudian et al., 1986; Picchioni et al., 1990), resistencia a diferentes enfermedades (Ashworth, 1985), vigor y hábitos reproductivos (Crane y Iwakiri, 1987), y eficiencia nutricional (Brown et al., 1994). No sólo se trata de una cuestión determinante, sino que además ninguno de los portainjertos presenta igual rendimiento en las diferentes zonas de cultivo a nivel mundial, proporcionando cada uno de ellos unas características diferentes al árbol según el sitio en el que éste crezca. Además, son interesantes los esfuerzos por caracterizar y desarrollar nuevas variedades cuyas singularidades puedan contribuir a su uso como portainjertos a nivel nacional o local. En este sentido, algunos autores han desarrollado marcadores moleculares que permiten no sólo trazar la filogenia del grupo sino también conocer la procedencia de distintos híbridos interespecíficos, muchos de ellos como se ha mencionado anteriormente serán potenciales portainjertos debido, entre otras cosas, a su fenotipo vigoroso. Teniendo en cuenta la interacción que existe entre portainjertos y variedad, en esta memoria se han testeado las siguientes hipótesis: 1. El tipo de portainjertos (Pistacia atlantica Desf. y Pistacia terebinthus L.) y/o de variedad de pistacho (`M38¿, `G1¿, `Mateur Macho¿, `Batoury¿ y `Joley¿) son determinantes en la capacidad de absorción de nutrientes de la planta. 2. Esta capacidad de absorción es modificable mediante distintos tratamientos (micorrizas y fitohormonas). 3. La concentración de nutrientes en la planta afecta directamente al porcentaje de prendimiento del injerto. 4. Es posible conocer la procedencia de híbridos interespecíficos de Pistacia mediante el uso de marcadores moleculares. Uno de los factores determinantes para poner a punto este cultivo es, no sólo el plan de abonado y el tipo de suelo, sino sobre todo el porcentaje de prendimiento del injerto, por lo que es interesante profundizar en el conocimiento sobre la utilización que hace la planta de cada uno de los elementos químicos en cuestión y su influencia en distintos procesos fisiológicos de la planta. Además, dada la gran cantidad de híbridos interespecíficos existentes en el género Pistacia, y su frecuente uso como portainjertos, es de gran interés ser capaces de conocer la procedencia de los mismos mediante el empleo de marcadores moleculares, lo que permitiría entre otras cosas, la obtención de variedades conocidas a través de cruzamientos dirigidos. Metodología. 1.- ANÁLISIS DE LA EFICIENCIA DE ABSORCIÓN DE NUTRIENTES EN PISTACIA TEREBINTHUS. Para la realización de este análisis, se cuenta con las plantas de Pistacia de uno de los principales productores de la provincia de Granada Viveros Zuaime SL, Caniles, Granada, que pone a nuestra disposición un total de 12.950 plántulas de un año de edad, homogéneas en vigor y talla, procedentes de un semillero de P. terebinthus L. Dichas plántulas son colocadas en una parcela con un patrón 2x1 y serán injertadas con plantas de P. vera L. Entonces, se han realizado tres grandes grupos de ¿4.000 individuos, siempre utilizando un diseño de bloques aleatorios, siendo estos también divididos en tres subgrupos, cada uno con uno de los siguientes tratamientos: (i) control: plantas que no reciben ningún tratamiento, (ii) fitohormonas: plantas tratadas con una mezcla de auxinas, giberelinas y citoquininas en el momento del trasplante para favorecer el crecimiento radicular vertical (Stimulate, Stoller, USA), y (iii) micorrizas: plantas inoculadas con una mezcla del hongo nativo Glomus spp. por inmersión de las raíces en una solución justo antes de la plantación (GLOMYGEL, Mycovitro SL, Spain). En todos los casos, las plantas serán provistas de irrigación comercial y la disolución estándar de nutrientes. Se ha utilizado un diseño en bloques completos aleatorizados para garantizar la independencia entre la concentración de los diferentes elementos químicos y el crecimiento de las plantas en la parcela. Cuando las plantas han alcanzado su tamaño óptimo, se realiza el injerto en escudo o en T, utilizando yemas de las variedades Kerman y Peter de pistacho (P. vera L.). Para el análisis de la concentración de elementos químicos en hoja se han de tomar 100 gr de tejido foliar de cada una de las plantas, dejarlos secar a 60°C durante 24h y después pulverizarlo finamente. Para el análisis del C y N totales se utilizará el Flash EA 1112 Series-LECO TRUSPEC. El resto de los elementos serán analizados por digestión con HNO3/H2O2 en el UltraClave Microwave Milestone, y ICP-OES utilizando un ICAP 6500 DUO. Estos estudios son realizados en el Laboratorio de Ionómica del CEBAS-CSIC (Murcia, España). Tanto los parámetros de crecimiento de las plantas como la concentración de elementos químicos en las hojas son evaluados con la utilización de test estadísticos como el análisis de la varianza de un factor (ANOVA) utilizando el paquete de software de SPSS (SPSS 10 para Windows, 2007). Para ello, deben ser controlados los requisitos indispensables de homocedasticidad y normalidad de las muestras analizadas. 2.- EVALUACIÓN DE LA EFICIENCIA EN LA ABSORCIÓN DE NUTRIENTES EN CINCO VARIEDADES DE PISTACHO, PISTACIA VERA L. En este caso, se utiliza un grupo de plantas pertenecientes a una colección de variedades mantenida en una parcela experimental del Centro Agrario el Chaparrillo, Castilla-La Mancha (España). Se trata de plantas adultas injertadas en P. atlantica Desf. (variedades hembra `Batoury¿ y `Joley¿; variedades macho `Mateur¿, `M38¿ y `G1¿). Para cada una de estas variedades analizamos la concentración de 30 elementos químicos utilizando la metodología de trabajo expuesta en el apartado anterior. Por último, vamos a comparar cuantitativamente estas concentraciones mediante distintos test estadísticos. Tras el análisis de normalidad y homocedasticidad de las muestras gracias a las pruebas de Saphiro-Wilk y de Levene respectivamente (¿ > 0.05), en este análisis optamos por el test no paramétrico de Friedman. Posteriormente, para comprobar las diferencias entre los distintos grupos de datos, se aplica como análisis post hoc el Test de Wilcoxon con suma de rangos y con una corrección de Bonferroni (p<0,025). La existencia de valores atípicos se descarta mediante el uso de la prueba de Grubbs. 3.- COMPARACIÓN DE LA ABSORCIÓN DE NUTRIENTES ENTRE PISTACIA TEREBINTHUS L. Y PISTACIA ATLANTICA DESF. Por último, se comparan los valores de concentración de elementos químicos en hoja procedentes de la parcela de Viveros Zuaime SL. y los de la del Centro Agrario el Chaparrillo, cuyas plantas de Pistacia son de diferentes variedades. Al igual que en el apartado anterior, para el análisis estadístico de los datos se utiliza un test no paramétrico de Friedman (¿ > 0.05) con una comprobación previa de la normalidad y homocedasticidad de los datos gracias a las pruebas de Saphiro-Wilk y de Levene respectivamente (¿ > 0.05), utilizando el paquete de software SPSS (SPSS 10 para Windows, 2007). 4.- CARACTERIZACIÓN GENÉTICA DE LA NUEVA VARIEDAD VIGROS. Para este estudio contamos con un grupo de semillas con características diferentes en cuanto al tamaño y la forma con respecto a las habituales en P. terebinthus. Fueron recolectadas en la Sierra de Baza, en Granada, durante la clasificación rutinaria de un material de Pistacia terebinthus L. Para la caracterización molecular, se deben germinar estas semillas en arena fina autoclavada, después de ser sumergidas en agua destilada hasta que surjan las raíces. Posteriormente, se dejaran crecer en semilleros para las plántulas de 6x4. Una vez germinadas las semillas, se eligen al azar algunos pies de planta de los que se recogerán hojas en cantidad suficiente como para llevar a cabo la extracción de ADN. Después de la recolección, las muestras se procesan e individualizan. Tras este tratamiento se procede a la extracción del ADN a partir de las hojas frescas conservando el resto de material foliar a -20 ¿C para posteriores procesados. El ADN se obtendrá con la utilización del kit comercial, ¿Invisorb® Spin Plant Mini Kit¿ (Invitek). Con el objeto de caracterizar molecularmente la nueva variedad, utilizamos los marcadores moleculares nucleares ITS1 e ITS2 (espaciadores intergénicos ribosómicos) y el gen ribosómico 5.8S, y los marcadores cloroplastidiales correspondientes a las regiones trnL-F y trnC-D. Una vez obtenidas las secuencias procedentes de la secuenciación de las dos hebras de ADN serán ensambladas utilizando el programa Geneious (Biomatters Ltd.). Se cotejan las secuencias obtenidas con las existentes en la base de datos de ADN de EMBL, EBI y GenBank, mediante el programa interactivo en red BLAST (Altschul et al., 1997) del NCBI, y todas estas secuencias se utilizarán para hacer análisis filogenéticos. Conclusiones. 1.- ANÁLISIS DE LA EFICIENCIA DE ABSORCIÓN DE NUTRIENTES EN PISTACIA TEREBINTHUS. ¿ Todas las variedades mostraron niveles de absorción equivalentes para 20 elementos de los 30 analizados (Al, B, Cr, Cu, Fe, K, Li, Mg, Mn, N, Na, Ni, P, Pb, S, Sr, Ti, Tl, V y Zn). ¿ Las diferencias en absorción de nutrientes observadas han de ser debidas al estado fisiológico de las plantas más que a la variedad en sí. ¿ La ausencia de diferencias entre variedades en estas condiciones, sugiere nuevamente que el estado fenológico de la planta es más relevante en cuanto a la adquisición de nutrientes que la variedad a la que pertenezca la misma. 2.- EVALUACIÓN DE LA EFICIENCIA EN LA ABSORCIÓN DE NUTRIENTES EN CINCO VARIEDADES DE PISTACHO, PISTACIA VERA L. ¿ En este análisis, Pistacia atlantica Desf. mostró concentraciones mayores de B, Ca, Sr, Fe, Li, Mg, Tl y V, mientras que C, N, P y Na presentaron una concentración foliar mayor en Pistacia terebinthus L. ¿ Entre éstos se encuentran varios macronutrientes (Ca y Mg), que suministran una mayor proporción de energía al individuo y que están en una mayor cantidad en la planta, y micronutrientes (B e Fe), generalmente presentes en una dosis mucho menor. ¿ No obstante lo dicho, no se puede obviar que aunque nuestros muestreos fueron realizados en el mismo periodo del año, las muestras procedían de lugares distintos (es decir, suelos con características probablemente distintas) y de pies de planta de distinta edad, por lo que futuras investigaciones serán necesarias para aclarar completamente la influencia del portainjertos en la absorción de nutrientes. 3.- COMPARACIÓN DE LA ABSORCIÓN DE NUTRIENTES ENTRE PISTACIA TEREBINTHUS L. Y PISTACIA ATLANTICA DESF. ¿ Las plantas micorrizadas mostraron un incremento estadísticamente significativo en Ca, Fe, Mg, N, Al, S, Sr, Ti, V, Mn, Tl, así como una disminución estadísticamente significativa de K, 77 días después del tratamiento con respecto a las plantas fitohormonadas y las plantas control. ¿ El perímetro y el diámetro de las plantas micorrizadas, fitohormonadas y control se mantuvo similar durante el experimento. Sin embargo, las plantas micorrizadas mostraron significativamente una talla menor que el resto de plantas. ¿ Aproximadamente un 80% de las plantas micorrizadas dieron lugar a prendimientos positivos, mientras que sólo el 32,3% and 38,4% de las plantas tratadas con fitohormonas y plantas controles, respectivamente, dieron lugar al mismo resultado. Por lo tanto, el uso de portainjertos de Pistacia terebinthus L. micorrizados podría aumentar la eficiencia del prendimiento hasta en un 40%. 4.- CARACTERIZACIÓN GENÉTICA DE LA NUEVA VARIEDAD VIGROS. ¿ Los datos aquí obtenidos demostrarían que las semillas estudiadas se corresponderían con un híbrido interespecífico entre las especies Pistacia vera L. and Pistacia atlantica Desf. ¿ Los marcadores cloroplastidiales demostraron que este híbrido presenta un haplotipo idéntico al existente en Pistacia vera L., con la que además comparte posiciones diagnóstico que las diferencias de otras especies. Esto sugeriría que Pistacia vera L. es el parental femenino, mientras que Pistacia atlantica Desf. es el parental masculino. Esta variedad fue protegida por la Oficina Europea para la Protección de Variedades Vegetales bajo la denominación de VIGROS. ¿ Esta combinación de marcadores moleculares ha demostrado ser efectiva para la determinación de la procedencia de los parentales de híbridos interespecíficos de Pistacia. Referencias bibliográficas. Ashworth, J., 1985. Verticillium resistant rootstock research. Annual Report of the Californian Pistachio Industry. Fresno, CA. pp. 54-56. Aznarte-Mellado, C., Sola-Campoy, P. J., Robles, F., Ruiz Rejón, C., de la Herrán, R., Navajas-Pérez, R., 2014. Mycorrhizal treatments increase the compatibility between Pistachio (Pistacia vera L.) cultivars and seedling rootstock of Pistacia terebinthus L. Scientia Horticulturae, 176:79-84. Aznarte-Mellado, C., Sola-Campoy, P. J., Robles, F., Ruiz Rejón, C., de la Herrán, R., Navajas-Pérez, R., 2014. Molecular characterization of the interspecific hybrid Pistacia vigros (P. vera L. x P. atlantica Desf.). 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Rootstocks Production and Budding, in: Ferguson, L. (Eds.), Pistachio Production. University of California, pp. 74-79. Picchioni, G. A., Miyamoto, S., Storey, J. B., 1990. Salt effects on growth and uptake of pistachio rootstock seedlings. J. Amer. Soc. Hort. Sci. 115:647-653. Tarango Rivero, S.H., 1993. El cultivo del pistachero. Colección Agropecuaria 1993. Ed. Departamento Editorial de la Universidad de Chihuahua, Mexico. Vargas, F.J., Romero, M.A., Batlle, I., Clavé, J., 1995. Estudio del vigor en familias de pistachero. In: VI Congreso de la Sociedad Española de Ciencias Hortícolas (SECH), Resúmenes. SECH, Barcelona (Spain), pp.198. Walker, R.R., Torokfalvy, E., Behboudian, N. M., 1987. Uptake and distribution of chloride, sodium and potassium ions and growth of salt-treated Pistachio plant. Aust. J. Agric. Res. 38:383-94.