Formation, stability and in vitro activity of colloidal systems for gene delivery

Resumen

El ADN presenta una estructura compacta en las células que ha motivado numerosos estudios teóricos y experimentales. A lo largo de los últimos veinte años, el número de publicaciones dedicadas a la condensación del ADN ha crecido exponencialmente, especialmente debido a su importancia para el desarrollo de alternativas más seguras que las virales para el transporte de genes. Los polímeros catiónicos forman de manera espontánea complejos interpolielectrolito (CIPE) con el ADN, debido principalmente a la fuerte interacción electrostática entre ellos. Gracias a la química de polímeros actual, pueden obtenerse estructuras poliméricas a la carta que permiten el diseño racional de agentes condensantes con diferentes dominios funcionales. Sin embargo, resulta chocante la escasa atención que reciben el comportamiento y las propiedades coloidales de los también llamados poliplejos, a pesar del papel fundamental que juegan el tamaño, la estabilidad, las propiedades eléctricas e interfaciales, o la morfología, en el éxito del sistema. Esta tesis se propone reducir la brecha entre el diseño racional de polímeros catiónicos para el transporte de genes, y su correspondiente transfección in vitro, a través de una amplia caracterización fisicoquímica de los sistemas coloidales. Más específicamente, hemos evaluado el papel de cadenas hidrofóbicas de diferentes longitudes en el proceso de condensación del ADN y las posteriores propiedades del sistema, analizando aspectos como el tamaño, las propiedades eléctricas, la estabilidad temporal, la morfología, la interacción con una membrana modelo, y finalmente la eficacia de transfección in vitro. También se ha investigado la influencia de parámetros como el pH y la fuerza iónica en la condensación. El desarrollo de un proyecto multidisciplinar como éste, exige la utilización de una amplia variedad de técnicas que abarcan desde procedimientos biológicos, como la transformación de bacterias, los cultivos de células de mamífero o ensayos de toxicidad, hasta herramientas fisicoquímicas como la dispersión de luz dinámica y estática, la microscopía electrónica o el análisis de la trayectoria de partículas (NTA, del inglés nanoparticle tracking analysis). Destaca particularmente el uso de la gota pendiente para evaluar la interacción de los poliplejos/polímeros con una membrana modelo constituida por una monocapa de fosfolípidos en la interfaz aire/agua. El profundo estudio biofísico que se ha realizado en esta tesis proporciona un mejor entendimiento del proceso de condensación del ADN y de algunos de los parámetros que lo modulan. En este trabajo hemos investigado el papel de las interacciones hidrofóbicas en la compactación del ADN, y los resultados indican que esta fuerza no sólo modula el tamaño y la morfología de los poliplejos, sino también la estabilidad, la interacción con una membrana modelo, la eficacia de transfección e incluso si el poliplejo se forma o no. Se ha demostrado que las técnicas experimentales utilizadas para la caracterización de los complejos son eficaces para establecer diferencias entre ellos basadas en el mecanismo de condensación, e indirectamente, en la estructura del polímero utilizado.