Modulación ejercida por los glucocorticoides sobre la función de barrera intestinal

Resumen

RESUMEN 1. INTRODUCCIÓN La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) es una patología crónica recurrente que afecta al tracto gastrointestinal, que a su vez engloba a dos trastornos inflamatorios de carácter idiopático: enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa. Ambas presentaciones de la EII empeoran significativamente la calidad de vida los pacientes y requieren de intervenciones médico-­¿¿ quirúrgicas que se prolongan en el tiempo. La principal razón que convierte a esta patología en especialmente interesante es que su etiología sigue siendo desconocida, lo impredecible de su sintomatología, la escasez de terapias que la aborden más allá del mero tratamiento sintomático y su creciente prevalencia especialmente en el mundo desarrollado. En la actualidad existen diversos tratamientos utilizados en el abordaje clínico de la EII en cualquier de sus manifestaciones, pero desafortunadamente a pesar de conseguir en una significativa proporción de los casos un manejo de la enfermedad bastante aceptable, presentan efectos adversos importantes y que aparecen con mucha frecuencia. Por consiguiente, la investigación encaminada a la obtención de nuevas herramientas terapéuticas orientadas a su tratamiento igualmente se encuentra justificada. Los glucocorticoides (GC) son un grupo de hormonas que fue descubierto por el Dr. Addison en el siglo XIX, a partir de los cuales se han desarrollado diferentes derivados sintéticos que se encuentran actualmente incluidos entre las opciones terapéuticas incluidas en el manejo clínico de diferentes desórdenes inflamatorios, entre ellos la EII. Los GC son unas moléculas de efectos pleiotrópicos, dado que presentan una farmacodinamia muy compleja y variada, pero que en esencia deriva de la interacción de las mismas con su receptor específico, el receptor de glucocorticoides (GR). El mecanismo de acción puede ser dividido en tres vertientes esenciales: la acción del GR como factor de transcripción activando la expresión de diferentes genes (transactivación), dicha acción pero reduciendo la expresión génica de otros genes diana (represión) y la interacción del GR con otros factores de transcripción modulando la funcionalidad de estos últimos por transrepresión ("¿tethering"¿ o atadura). Los efectos inmunomoduladores de los GC que los convierten en moléculas útiles en el tratamiento de la EII son producto de la conjunción de estos efectos a nivel de expresión génica sobre diferentes dianas terapéuticas, aunque en general se considera que dichos efectos dependen fundamentalmente de la transrepresión y represión clásica, mientras que los efectos catalogados como adversos lo hacen principalmente de la transactivación. En la actualidad existe una gran variedad de GC disponibles para su uso clínico en virtud de sus efectos antiinflamatorios e inmunosupresores. Entre los utilizados para el manejo clínico de la EII destacan prednisolona y metilprednisolona administradas de forma sistémica, y la budesonida administrada vía oral persiguiendo un efecto fundamentalmente local gracias a su elevado efecto de primer paso hepático. El uso de los GC en el tratamiento de la EII cuenta con algunos problemas asociados que limitan en gran medida su eficacia. De hecho, solo un 40% de los pacientes responden adecuadamente a estos fármacos, mientras que el resto o son corticorresistentes o se convierten en dependientes de los GC cuando entran en estado de remisión. Además, hoy en día está totalmente aceptado que la administración de GC no genera ningún beneficio si se usa buscando la permanencia en el estado de remisión. Las evidencias experimentales basadas en la aplicación de GC sintéticos en diferentes modelos de colitis experimental surgieron a posteriori con respecto a su uso empírico en la clínica, siendo en su mayoría fiel reflejo de su potente actividad antiinflamatoria e inmunomoduladora que les hace presentar efectos muy beneficiosos sobre los marcadores fisiopatológicos y la supervivencia de los animales. Sin embargo, el caso concreto de la colitis inducida por DSS supone una excepción a este principio. Este hecho ha sido constatado a lo largo de las dos últimas décadas, durante las que han surgido diversos trabajos que haciendo uso de los GC en general, y la budesonida en particular (elegido en principio por su profuso uso clínico), muestran datos que indican de forma inequívoca que aquellos animales que reciben el GC ven incrementada la severidad del modelo y la tasa de mortalidad en comparación con el grupo colítico no tratado. Sorprendentemente, a pesar de la consistencia de estas evidencias obtenidas de forma repetida en diferentes laboratorios y con diferentes cepas de ratón, en ninguno de ellos se profundiza en las razones que pudieran justificar un comportamiento tan desfavorable de uno de los fármacos de aplicación actual directa en la terapia de la EII, al ser utilizados en uno de los modelos experimentales de EII probablemente más usados desde hace años. En general, los GC ejercen sus acciones inmunomoduladoras actuando sobre una gran diversidad de tipos celulares debido a la ubícua expresión del GR. Los efectos antiinflamatorios e inmunosupresores de los GC se encuentran asociados a la regulación negativa de la acción de muchos factores de transcripción de carácter inflamatorio como NFkB, STAT3, AP-­¿¿1. etc, en la medida que sus genes diana son proteínas implicadas directamente en las respuesta inflamatorias. No obstante, existen ejemplos destacados de la estimulación de la expresión de determinadas proteínas por transactivación desencadenada por GC, que colaboran en el efecto antiinflamatorio. Un ejemplo paradigmático de esta situación, es el caso de la proteína mitogen activated protein kinase (MKP¿1). El efecto de los GC sobre los diferentes tipos celulares implicados en el sistema inmune gastrointestinal se encuentra bastante descrito. Sobre los linfocitos T ejercen un efecto antiproliferativo, proapoptótico e inhibidor de la secreción de citoquinas. Sin embargo, poco se sabe acerca de sus efectos sobre las células B aunque parece ser que producen una reducción de su presencia relativa en los ganglios mesentéricos (MLN). En lo relativo a las células presentadoras de antígenos, los GC producen un efecto inhibidor de su actividad sobre todo debido a que las polarizan hacia un comportamiento tolerogénico. Además, el que es probablemente el componente más decisivo en las acciones antiinflamatorias de los GC, es su capacidad para reducir la extravasación e infiltración leucocitaria de células inmunocompetentes hacia los focos inflamatorios. Este último efecto descrito, parece depender de una reducción de la expresión de las moléculas de adhesión en el endotelio vascular y en las células polimorfonucleares susceptibles de infiltrar el foco inflamatorio. Además, en el contexto de la mucosa intestinal no se puede obviar el papel de las células epiteliales intestinales. Los efectos de los GC sobre este tipo celular que se encuentran descritos hasta la fecha, hacen referencia fundamentalmente a una intensa estimulación de la maduración de las células epiteliales en proliferación, efecto del cual derivan algunas de sus aplicaciones en el campo de la obstetricia. Además, recientemente se ha descrito un interesante efecto modulador de los GC sobre la microbiota intestinal, que parece ejercer un papel relevante en el efecto antiinflamatorio general de los mismos en algunos modelos de inflamación intestinal, aunque la lógica dicta que incomparable en términos cuantitativos con los ejercidos de forma directa sobre células inmunocompetentes. Desafortunadamente no se describe el mecanismo exacto que subyace en este efecto beneficioso que ha sido puesto de manifiesto usando el modelo de colitis espontánea en animales IL10 KO, aunque debe estar relacionado con efectos indirectos secundarios a los efectos sistémicos de la dexametasona. En este trabajo tampoco queda claramente definida la contribución relativa de las acciones directas de los GC sobre las células epiteliales intestinales, aunque se puede inferir que su estimulación de la producción de mucinas puede ser importante en ese sentido. En las respuesta inflamatorias localizadas a nivel intestinal, se produce un incremento muy relevante de una gran cantidad de citoquinas y quimioquinas proinflamatorias, así como un aumento de la señalización de diferentes rutas de señalización intracelular orientadas a conducir los efectos de los mediadores solubles implicados en el desarrollo la reacción inflamatoria. Tradicionalmente, un efecto antiinflamatorio de amplio espectro como el que presentan los GC, se ha considerado beneficioso en el tratamiento sintomático de este tipo de desórdenes, ya sea a nivel experimental o clínico. Sin embargo, en la actualidad este concepto ha sido profundamente revisado. De hecho, hoy en día se sabe que en algunos modelos experimentales de colitis como la inducida por DSS, el bloqueo de la señalización o la producción de mediadores como la IL22, IL27, IL17A, IL1ß, GMCSF o KC/CXCL1, así como del funcionamiento de rutas de señalización como la canónica de NFkB o de receptores implicados en la inmunidad innata como los TLR, genera un notable incremento de la severidad del modelo experimental en cuestión. 2. OBJETIVOS De acuerdo con los conceptos descritos arriba, se proponen los siguientes tres objetivos para esta tesis doctoral: 1. Confirmar el impacto negativo de los GC administrados vía oral en el modelo de colitis experimental inducido por DSS, contraponiéndolo con su efecto sobre la severidad de un modelo de colitis exclusivamente mediado por células T. 2. Dilucidar los eventos de tipo sistémico que concurren en los animales que sufren de colitis inducida por DSS mientras reciben GC vía oral, que puedan ser justificativos de la elevada tasa de mortalidad que les caracteriza. 3. Caracterizar mediante estudios in vitro aquellas acciones moleculares de los GC sobre los diferentes tipos celulares que participan activamente en la función de barrera intestinal, que puedan contribuir a sus efectos in vivo sobre la colitis inducida por DSS. 3. MATERIAL Y MÉTODOS La consecución de estos objetivos se ha llevado a cabo utilizando diversas técnicas que incluyen, el cultivo celular, PCR cuantitativa a tiempo real, separación celular magnética, histología, citometría de flujo, cámara de Ussing, Western Blot, ELISA y diferentes modelos experimentales de colitis (DSS y transferencia linfocitaria). 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Nuestros resultados pueden ser divididos en dos secciones principales. IN VIVO La budesonida fue administrada a animales sometidos a colitis aguda inducida por DSS (experimentos DSS1 y DSS2). En estos experimentos la administración del GC incrementó la severidad del modelo experimental de forma dosis dependiente, al menos en lo que a la evolución del peso corporal, el estado general de los animales y su supervivencia se refiere. Este efecto también se tradujo en un descenso de la fibrosis colónica macroscópica y del peso del bazo, así como en una reducción notable de la actividad mieloperoxidasa (MPO) colónica. Curiosamente, se produjo un incremento de la actividad fosfatasa alcalina (AP) y de su sensibilidad a levamisol ensayada in vitro, exclusivamente en el grupo colítico que recibió budesonida a una dosis de 60 µ¿g/ratón/día. En consonancia con esto, la elevación de linfocitos y monocitos en sangre periférica inducida por la inflamación, se vio reducida por el GC desde la dosis de 6 µ¿g/ratón/día en adelante. El efecto antiinflamatorio de la budesonida en estas condiciones experimentales, también queda patente en los resultados arrojados por el análisis del tejido colónico mediante PCR a tiempo real. En estos resultados, se puede observar que el GC reduce de forma consistente y dosis dependiente la expresión de marcadores inflamatorios clásicos de este modelo como la IL6, S100A8 o IL17A, entre otros. Además, resultados congruentes con estos se obtuvieron al determinar citoquinas como IL22, IL27, GMCSF, IL6 o IL17A en el sobrenadante del cultivo de explantes colónicos. En estas condiciones experimentales además evaluamos el estado proliferativo del epitelio mucosal. Los resultados de expresión proteica del antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA) en células epiteliales aisladas, de incorporación de BrdU y de expresión génica de Cyclin D1 y c-­¿¿ jun en colon total, informan claramente del efecto inhibidor de la budesonida sobre la respuesta hiperplásica mucosal ante la agresión del DSS. El tejido colónico de estos animales fue sometido montado en cámara de Ussing y testado para su permeabilidad paracelular. En este caso, la administración del GC se asoció con una reducción de la misma, probablemente de forma secundaria al efecto antiinflamatorio demostrado anteriormente, ya que resulta coherente con la recuperación parcial inducida por la budesonida de la corriente de cortocircuito basal, la cual se reduce drásticamente por la inflamación. La administración del GC también se correlacionó con un marcado incremento de la traslocación bacteriana a MLN e hígado, así como de la presencia de lipopolisacárido (LPS) en este último órgano. Este fenómeno nos hizo sospechar sobre la concurrencia de un proceso séptico en los animales colíticos que recibieron el GC. Por tanto, evaluamos diferentes parámetros a nivel sistémico clásicamente utilizados en la monitorización de la sepsis experimentalmente inducida. De acuerdo con nuestras sospechas, los grupos colíticos tratados mostraron signos de sepsis. No obstante, mientras algunos parámetros como la expresión de iNOS, IL1ß e IL6, la ratio p-­¿¿ eNOS/eNOS y la actividad mieloperoxidasa a nivel pulmonar, así como la histología de este tejido, solo aumentaron en los animales que recibieron la dosis de 60 µ¿g/ratón/día. En otros como la hipotermia, la IL18 plasmática o los nitratos/nitritos en plasma el incremento respecto al grupo colítico no tratado se manifestó desde dosis tan bajas como 1 y 3 µ¿g/ratón/día. En este trabajo también se ha testado el efecto de la budesonida en la colitis aguda inducida por DSS en animales sometidos a una intensa depleción en su microbiota (DSS-­¿¿ PGF). En este caso, la administración del GC también se asoció con un aumento de la severidad del modelo, a pesar de que la inflamación asociada a la administración de DSS en estas condiciones es prácticamente inexistente. En primer lugar, comprobamos que los efectos negativos de la budesonida en este caso no estaban asociados a la traslocación bacteriana y a una sepsis secundaria a la misma. Por otro lado, encontramos un aumento muy evidente de la sangre en heces en el grupo colítico expuesto a budesonida en condiciones de depleción bacteriana, que coherentemente apareció incrementada cuando fue analíticamente determinada y se acompaño de un dramático descenso de los eritrocitos, hemoglobina y hematocrito sanguíneos. Además, también encontramos en el grupo que recibió budesonida un marcado aumento de la permeabilidad intestinal a FITC-­¿¿dextrano analizada in vivo. Este fenómeno, asociado a la inhibición de la restitución del epitelio mucosal ante la agresión del DSS inducida por la depleción bacteriana y acrecentada por la administración del GC, caracterizado por la determinación de la expresión de Cyclin D1, nos permitió identificar como causa del desfavorable efecto del GC en este caso, a una masiva alteración de la función de barrera. Asimismo, encontramos una reducción de la expresión colónica de la fosfatasa alcalina intestinal (IAP) y leucine reach-­¿¿repeat containing G protein coupled receptor 5 (LGR5) (genes diana de ß-­¿¿catenina), lo que también pudo contribuir parcialmente al efecto observado y que se correlacionó perfectamente con un aumento de la presencia de dickkopf-­¿¿1 (DKK1) en plasma. Una vez puesto de manifiesto el efecto de la budesonida cuando esta es administrada durante la inducción de la colitis aguda por DSS, decidimos explorar sus efectos cuando se administra exclusivamente antes de la inducción de la colitis (DSS3). Al contrario de lo descrito con anterioridad, en este caso la administración del GC se asoció con una notable mejoría de la evolución del peso de los animales y su estado general. Esto se acompañó de una evidente aunque sutil reducción de la inflamación intestinal, evidenciado por un descenso en parámetros como la relación peso/longitud colónica, la actividad fosfatasa alcalina colónica y la concentración de monocitos sanguíneos. A modo de comparación con los experimentos anteriormente descritos, es interesante destacar que no se observó una exacerbación del sangrado rectal, ni un descenso en los eritrocitos o la hemoglobina en sangre. Tampoco se observó traslocación bacteriana o de LPS alguna a tejidos extraintestinales, lo que resulta coherente con la total ausencia también de signos de sepsis a nivel sistémico. Todo este conjunto de resultados nos permite pensar que los efectos descritos en DSS1 y DSS2 requieren necesariamente de la coexistencia temporal de la administración del GC y de la inducción de la colitis. Con la intención de cumplir con uno de los objetivos de esta tesis doctoral, que incluía el análisis de las acciones de la budesonida en un modelo de colitis no químico y dirigido por células T, se evaluó el efecto de la misma en el modelo de colitis inducida por transferencia linfocitaria, siendo administrada a dosis comparables a las utilizadas en el modelo de DSS. La administración de budesonida a este tipo de ratones colíticos, aún sin aportar un beneficio a nivel de la evolución del peso de los animales, generó una clara mejoría del estado general de los animales de un modo secundario a un efecto antiinflamatorio evidente. Dicho efecto que en general presenta un claro perfil dosis dependiente, queda puesto de manifiesto atendiendo los resultados obtenidos en relación a parámetros como la relación peso/longitud, fibrosis y actividad mieloperoxidasa colónicas, la concentración de citoquinas del sello Th1 en plasma, la abundancia relativa de células CD4+ IFN¿+ en los MLN analizada por citometría de flujo, la producción de IL17A estimulada por concanavalina A en esplenocitos y la expresión colónica evaluada por PCR a tiempo real de marcadores como IFN¿, IL1ß, IL6, CXCL1, S100A8, REG3¿ e IL17A. En este experimento también estudiamos la traslocación bacteriana inducida por la inflamación en sí misma y si el GC producía alguna modulación en dicho fenómeno. En línea con la bibliografía existente, no se observó traslocación a hígado, mientras esta en los MLN fue alrededor de 100 veces inferior a la encontrada en los controles colíticos en el modelo de DSS. Por su parte la administración del GC en este modelo, a diferencia de lo ocurrido en la colitis inducida por DSS, no generó un incremento significativo de la traslocación en ninguno de los tejidos considerados, lo que resulta coherente con los resultados negativos en los que la administración de budesonida no incrementó los valores encontrados para los parámetros que sirven como indicadores de sepsis a nivel sistémico en los ratones colíticos. IN VITRO Estudios en células epiteliales intestinales El efecto de los GC sobre la respuesta ante la estimulación con LPS, la cual fue monitorizada mediante la determinación de quimioquinas en el sobrenadante del cultivo celular, fue estudiado haciendo uso de las líneas celulares murinas IEC4.1 e IEC18. Estos experimentos mostraron un claro efecto inhibidor de dicha respuesta que siguió un perfil dosis dependiente. Además, la budesonida resultó ser el más potente en este contexto, mientras que la hidrocortisona fue el menos eficaz. De hecho, mientras que el efecto de la budesonida se saturó a una concentración de 0.1 µ¿M, en cualquier del resto de GC ensayados ocurrió lo propio a una concentración probablemente intermedia entre 1 y 10 µ¿M. Se obtuvieron resultados comparables cuando la estimulación se realizó con peptidoglicano (PGN). Además, los GC (principalmente budesonida y dexametasona) estimularon de forma consistente la expresión de toll-­¿¿like receptor 4 (TLR4) en las células IEC4.1. Por tanto, no resulta sorprendente el aumento de la sensibilidad a LPS que indujo la preexposición de estas células a GC antes de recibir dicho estímulo. Debido a la importancia de la restitución epitelial en la respuesta de la mucosa intestinal a la agresión por DSS, con la intención de complementar los hallazgos obtenidos en los experimentos in vivo, evaluamos el impacto de los GC sobre la curación de una herida epitelial in vitro. Nuestros resultados muestran como todos los GC producen, siguiendo un perfil dosis dependiente, un retraso en la curación epitelial tanto en condiciones basales como bajo estimulación de la proliferación y migración celulares mediante la adición al cultivo de IL22, IL27 o KGF. Por otro lado, hemos analizado la influencia de los GC sobre la sensibilidad de las células IEC4.1 e IEC18 a la invasión por parte de bacterias con carácter enteroinvasivo como las E. coli LF82. Nuestros resultados en este sentido son muy contundentes, reflejando un efecto favorecedor de dicho fenómeno por parte de todos los GC en el caso de las células IEC18, y de forma exclusiva y dosis dependiente por parte de la budesonida en las células de ratón IEC4.1. Debido a las evidencias encontradas en los experimentos in vivo que parecían sugerir un efecto inhibidor de la señalización de la ruta Wnt/ß-­¿¿catenina asociado a la administración de budesonida, decidimos explorar los efectos de los GC sobre la respuesta de las células IEC4.1 a R-­¿¿spondin-­¿¿1 (RSPO1). Los resultados presentados en relación a estos experimentos reflejan la práctica ausencia de efectos directos de los GC sobre dicha cascada de señalización. Sin embargo, cuando en una serie de experimentos generando medios condicionados se testaron los efectos de tipo indirecto mediados probablemente por la producción epitelial de mediadores solubles con acción antagonista sobre los receptores low density lipoprotein receptor-­¿¿related protein 6 (LRP6) que reconocen a RSPO1, se observó que la exposición de las células IEC4.1 a GC hace que estas condicionen el medio de forma que la estimulación generada por RSPO1 en dicho medio se vea fuertemente atenuada. En consonancia con esto, la exposición de células IEC4.1 a GC durante 4 días produjo un fuerte aunque irregular incremento de la expresión de DKK1. De este modo, parecía plausible que esta proteína estuviera incrementada en los medios condicionados por células previamente expuestas a GC, pero desafortunadamente no llegamos a detectar dicha proteína por ELISA en ninguna de las condiciones experimentales. Por tanto, el efecto antes descrito no es achacable a DKK1 en exclusiva en ningún caso, pero tampoco es descartable que esta proteína ejerza cierta contribución junto con otros mediadores solubles en dicho efecto. Para terminar con los estudios realizados con células epiteliales intestinales, analizamos los efectos de los GC sobre la permeabilidad paracelular a FITC-­¿¿dextrano de monocapas de células IEC4.1, IEC18 y CACO-­¿¿2 dispuestas en un sistema de Transwell®. Nuestros resultados sugieren una respuesta diferencial entre las líneas celulares murinas (IEC4.1 e IEC18) y la humana (CACO-­¿¿2). Mientras que la exposición a GC durante 48 horas de las monocapas de las dos primeras líneas celulares indujo una reducción del paso del fluoróforo al compartimento basolateral, probablemente por razones relacionadas con el estado escasamente diferenciado propio de estas células, en el caso de las células CACO-­¿¿2 el efecto fue radicalmente opuesto. Además, en las células de origen humano, la desorganización del sellado intercelular asociada la exposición a GC fue mucho más evidente cuanto mayor fue el grado de diferenciación de las mismas. Estudios en células presentadoras de antígenos y células T CD4 Estudios previamente publicados han puesto de manifiesto de forma extensa los efectos inmunomoduladores (principalmente inmunosupresores) de los GC sobre los diferentes tipos celulares implicados en el sistema inmunológico gastrointestinal. A pesar de ello, en esta tesis doctoral decidimos corroborar detalladamente el modo en que estas moléculas afectan a la producción de citoquinas especialmente relevantes en la respuesta fisiológica del hospedador ante el DSS, con la intención de poder realizar una mejor interpretación de los resultados obtenidos en los experimentos in vivo. Estos ensayos se realizaron haciendo uso de los tipos celulares que suponen las fuentes principales de nuestras citoquinas de interés, destacando sobre todo las células presentadoras de antígenos. En esta sección de los resultados, se presentan evidencias que reflejan la inhibición generada por los GC sobre la producción de citoquinas como la IL22, IL27 y la IL6, por parte de células dendríticas o células T CD4+ purificadas de bazo de animales sanos por separación celular magnética, células dendríticas derivadas de médula ósea y esplenocitos totales. Para poder obtener una producción de las citoquinas objeto de estudio que fuera determinable mediante ELISA y así poder observar el potente efecto inhibidor de los GC sobre su producción, los diferentes tipos celulares fueron activados con estímulos como IL23, LPS, PGN o CpGDNA. Los resultados derivados de estos ensayos presentados en esta tesis doctoral, nos permitieron confirmar el potente efecto inhibidor de la respuesta a dichos estímulos por parte de la mayoría de los tipos celulares ensayados ejercido por los GC. Este efecto fue tan relevante que en muchos casos las células tratadas con GC y expuestas al estímulo no liberaron una cantidad de citoquina al medio significativamente superior a las células control no estimuladas. 5. CONCLUSIONES 1. La budesonida, y presumiblemente los GC en general, presentan una interesante dualidad de acción sobre la mucosa intestinal inflamada: por un lado una marcada acción antiinflamatoria local, y por el otro una acción perjudicial relacionada con un debilitamiento de la función de barrera que se traduce en efectos negativos a nivel sistémico. Ésta última se traduce en un severo deterioro del estado general de los animales e incluso en su muerte. 2. Nuestros datos sugieren que la acción perjudicial se manifiesta cuando existe una importante lesión en el epitelio intestinal (modelo de colitis aguda por DSS). Sin embargo, este efecto queda en un segundo plano cuando el compromiso de la barrera epitelial es más sutil (colitis por transferencia linfocitaria o animales no colíticos). 3. El debilitamiento de la función de barrera intestinal producida por los GC se traduce en un incremento de la traslocación bacteriana que se encuentra asociada a la inhibición de los mecanismos inmunológicos de contención de la carga bacteriana en la luz intestinal y de los mecanismos de reparación epitelial. 4. Los estudios in vitro llevados a cabo en células epiteliales intestinales indican que existen ciertas diferencias entre los cuatro GC ensayados en relación a la modulación que ejercen sobre la invasión epitelial por parte de bacterias enteroinvasivas, la producción de citoquinas en respuesta a patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) y la curación de herida epitelial, aunque serán necesarios experimentos adicionales para detallar esta respuesta diferencial. De hecho, paralelamente a la ejecución de los experimentos recogidos en esta tesis doctoral, se ha desarrollado un ratón transgénico con deleción inducible del GR exclusivamente a nivel de células epiteliales intestinales, lo que nos permitirá dilucidar la relevancia relativa de este tipo celular en el efecto de los GC, tanto aquellos producidos localmente en el tejido intestinal o los administrados exógenamente en la colitis por DSS, así como su papel general en la homeostasis intestinal en condiciones basales y en otros modelos de inflamación intestinal. 5. Nuestros resultados tienen posibles implicaciones en el manejo clínico de pacientes con EII haciendo uso de GC de efecto local o sistémico, particularmente si la patología se acompaña de un significativo incremento de la permeabilidad intestinal y/o traslocación bacteriana. Asimismo, existen otros desórdenes como el síndrome metabólico que cuentan con alteraciones en la función de barrera intestinal en la base de su fisiopatología, en los que atendiendo a nuestros resultados los GC podrían ejercer cierta influencia teóricamente negativa. SUMMARY 1. MATERIAL AND METHODS To carry out these objectives, we used a wide variety of techniques, including tissue culture techniques, real time PCR, magnetic cell separation, histology techniques, flow cytometry, Ussing chambers, Western Blot, ELISA as well as different models of colitis (DSS and lymphocyte transfer model). 2. INTRODUCTION Inflammatory bowell disease (IBD) is a chronic relapsing inflammatory disorder of the gastrointestinal tract that encompasses two idiopathic and major inflammatory diseases: Crohn'¿s disease and ulcerative colitis. Both forms of IBD significantly impair quality of life, and require prolonged medical and/or surgical interventions. What makes it particularly challenging is its still unknown cause, its unpredictable presentations and symptoms, the less than optimal treatments, and a rise in its incidence and prevalence in many areas of the world. Now there are several therapeutic options available to face the clinical management of the IBD regardless its manifestation, but unfortunately, in spite of they normally suceed in most of the patients controlling their inflammatory condition, almost every single option has important and quite frequent side effects that partially limit their clinical use. Therefore, research efforts focusing on the search of new drugs for the treatment of this clinical conditions are needed. Glucocorticoids (GC) are a group of hormones that were discovered for the first time by Dr. Addison by the end of the nineteenth century, from which there have been developed several synthetic derivatives currently included among the therapeutic options available for the treatment of many inflammatory disorders like IBD. Glucocorticoids are molecules with pleiotropic effects, given that they are featured by a fairly complex mechanism of action that basically depends on the interaction with its primary biological target, the cytoplasmic glucocorticoid receptor (GR). The mechanism of action of GC can divided into three different aspects: the GR action as a transcription factor activating the expression of different genes (transactivation), that action but reducing the genetic expression of a given target gene (repression) and the interaction of the GR with other transcription factors modulating eventually its function by tethering (transrepression). The immunomodulatory effects of GC that are on the basis of its effectiveness as a tool for the treatment of IBD, rise mainly from the effects at the genetic expression level, even though is generally accepted that these effects come preferentially from transrepression and classical repression, while the majority of the side effects are related with the transactivation. Nowadays, there is a wide variety of synthetic GC available for its clinical use by virtue of their antiinflammatory and immunosuppressive effects. Among those receiving more attention by clinicians involved in the treatment of IBD are prednisolone and metilprednisolone administered sistemically (intravenous for instance), and the budesonide by oral administration chasing a local effect taking advantage of its significant first hepatic step. The use of GC in the treatment of IBD has some significant limitations. Actually, only around 40% of the patients respond normally to these drugs, while all the rest do not respond at all or respond at the beginning of the treatment but become dependent when they reach the remission state. Besides, now is fully accepted that GC administration does not offer any benefit when administered trying to extend the remission state. The experimental evidence currently available based on the application of synthetic GC in different models of colitis rised after their empirical use in humans. Accordingly with the well known antiinflammatory actions of these molecules, the majority of the results already published reflect a positive impact on the animal'¿s condition and survival. However, in the case of the acute DSS-­¿¿induced colitis the effect of the GC administration was surprisingly different. During the last two decades, many different researchers have published results that somehow support that assertion making use of GC in general, but particularlly budesonide because of its profuse use in the IBD treatment. Most of these articles conclude that those colitic animals that receive budesonide at the same time that DSS, suffer a sharp increase in their susceptibility to the model with a higher mortality during the colitis induction if compared to the non treated colitic group. Surprisingly, in spite of the consistency of that evidences obtained in different laboratories and making use of different mouse strains, none of these researchers went further trying to get some clues that could shed some light on that results. This is particularly rare taking into account that the budesonide is one of the therapeutic tools more oftenly prescribed for the IBD management. In general, GC exert their immunomodulatory effects throught the interaction with many different cell types because the ubiquitous expression of the GR. These effects are closely dependent on the negative regulation of transcription factors like NF¿kB, STAT3, AP¿1, etc., that play a pivotal role building inflammatory responses since their target genes in most of the cases encode for proinflammatory proteins. Nevertheless, there are some cases of proteins (MKP¿1 for instance) whose expression is enhanced by the GR by transactivation, and colaborate actively in the antiinflammatory effects induced by GC. The majority of the effects of GC on the different cell types involved in the regulation of the intestinal immune system have been already elucidated. Focusing on T cells, GC exert antiproliferative and proapoptotic effects on this cell type, but also a remarkable inhibitory action of its cytokine secretion. However, little is known about the effects of GC on B cells, although some articles suggest that they reduce their relative abundance among the cells of the MLN. Considering the antigen presenting cells, GC mediate a strong inhibition of its antigen presenting function, but also polarize them towards tolerogenic-­¿¿inducing behaviour. Besides, GC dramatically reduce the extravasation and infiltration to inflammatory sites of leucocytes, through a reduction of the expressión of adhesion molecules in the vascular endothelium and the infiltrating cells. The latter effect, is probably the most determinant in the overall antiinflammatory action of GC. Given that this thesis focuses on the effects of GC in the intestinal environment, we cannot rule out the importance of the effects of GC on the intestinal epithelial cells. All that is known to date about this point, is that GC significantly enhance the expression of mature features on these cells, what make them fairly useful in obstetrics. Futhermore, it'¿s been recently described an interesting modulatory effect of GC by means of which they produce qualitative changes on the intestinal microbiota. Attending to some recently released articles, this effect could contribute significantly to the overall antiinflammatory effect of the GC in several experimental models of intestinal inflammation, like the spontaneous colitis developed by IL10 KO mice. Unfortunately, the mechanism underlying this effect has not been described yet, although it should be related to indirect effects evoked by the systemic distribution of the GC and at the same time it'¿s been hypothesized that the GC-­¿¿induced modulation of mucins production by intestinal epithelial cells could be decisive. The inflammatory responses located in the intestinal area, oftenly course with an enhancement of a wide variety of proinflammatory citokines and chemokines, as well as a stimulation of some signalling pathways that play a pivotal role driving the effects of different inflammatory soluble mediators. For years, wide range antiinflammatory effects like those developed by GC, have been considered as extremely beneficial and thus used for the treatment of inflammatory disorders like IBD. However, now this approach has been extensively revised. Actually, nowadays many experimental evidences making use of inflammatory models like the DSS-­induced colitis, revealed a concept by which blocking the effects of proinflammatory mediators like IL22, IL27, IL17A, IL1ß, GMCSF or KC/CXCL1, as well as the functioning of signaling pathways like the canonical NF¿kB or those that follow the activation of innate immunity receptors like TLR, increase the severity of the experimental model. 3. AIMS Based on all the above, we proposed 3 main objectives in this doctoral thesis: 1. To confirm the negative impact of GC administration by oral gavage on the DSS-­¿¿ induced colitis, countering that phenomenon with the effects of comparable doses of GC on a chronic and T cell-­¿¿driven model of colitis. 2. To elucidate the systemic events that take place in the animals receiving GC when they are exposed at the same time to the acute DSS-­¿¿induced colitis, that could at least partially explain the increased severity and eventually the higher mortality displayed by these animals. 3. To describe in detail by in vitro studies those actions of GC at the molecular level on the different cell types actively involved in the intestinal barrier function, trying to link them with the effects of these molecules on the acute DSS-­¿¿induced colitis in mice. 4. RESULTS AND DISCUSSION Our results can be split into two main sections. IN VIVO The budesonide was administered to colitic mice exposed to the acute DSS-­¿¿induced colitis (DSS1 and DSS2 experiments). In these experiments the administration of budesonide elicited an enhancement of the disease severity in a dose dependent fashion, at least considering the body weight evolution, the general condition of the animals and the survival rate. It is noteworthy that some healthy animals received the GC as well and did not showed any of the deleterious effects induced by the budesonide when co-­¿¿administered with DSS. These harmful effects of the budesonide coincide with a consistent antiinflammatory effect, as reflect the significant reduction of the macroscopical colonic fibrosis, the colon weight/length ratio and the spleen weight, as well as a prominent lowering of the colonic myeloperoxidase (MPO) activity. Strikingly, all of this was accompanied by an increase of colonic alkaline phosphatase (AP) activity and its in vitro sensitivity to the inhibitor levamisol, but exclusively in the colitic group that received 60 µ¿g/mouse/day of budesonide. In line with this, the elevation of the blood lymphocyte and monocyte concentration secondary to the intestinal inflammation was reduced by the GC from the dose of 6 µ¿g/mouse/day onwards. The evident antiinflammatory effect of the budesonide in these experimental settings, become also evident attending to the results of the analysis of the colonic tissue expression by real time PCR. In this analysis we can observe that the administration of the GC reduced dose-­¿¿ dependently the expression of different hallmark indicators of the inflammation triggered by the DSS, like IL6, S100A8 or IL17A. Besides, consistent results were obtained when we focused on the production of cytokines like IL22, IL27, GMCSF, IL6 or IL17A by cultured explants of colonic tissue. It'¿s currently accepted that the intestinal epithelium proliferation and restitution after the DSS-­¿¿induced damage, plays a pivotal and irreplaceable role for recovering the intestinal homeostasis and thus on the animal general condition. Therefore, in order to get some clues regarding on this phenomenon we studied the cell proliferation nuclear antigen (PCNA) expression at the protein level in isolated intestinal epithelial cells, the BrdU incorporation and the genetic expression in colon of Cyclin D1 and c-­¿¿jun. All the results we obtained fit with the pretty well known hyperproliferative response elicited by DSS-­¿¿induced inflammation, and with a strong and dose-­¿¿dependent inhibition of that response in the colitic animals that received budesonide. The colonic tissue of these animals was also mounted in Ussing chambers and tested for its paracellular permeability using FITC-­¿¿dextrane as a probe. In this analytical approach, the GC administration reduced the tissue permeability, probably because of the previously described antiinflammatory effect of the treatment, given that this is consistent with the partial improvement of the short circuit currentvalues that were dramatically reduced by the inflammation. The administration of budesonide also correlated with a sharp enhancement of the bacterial translocation to mesenteric lymph nodes (MLN) and liver, as well as with the presence of LPS in the latter. This evidences prompted us to wonder about the coexistence of a septic process in the colitic animals exposed to the GC. Therefore, we evaluated some systemic parameters classicaly used to monitor the experimentally induced septic shock. According to our suspicions about this issue, the colitic mice treated with budesonide showed clear signs of sepsis. Nevertheless, while some of the sepsis makers in lung tissue like the iNOS, IL1ß and IL6 expression, the p-­¿¿ eNOS/eNOS ratio and the MPO activity, as well as the histological study of this tissue, were only significantly increased in those animals receiving 60 µ¿g/mouse/day of budesonide, other markers like hypothermia or the plasmatic IL18 and nitrates/nitrites concentration, were upregulated by the GC administration with a lower dosage (1 and 3 µ¿g/mouse/day). In this work we also evaluated the effect of the budesonide on the acute DSS-­¿¿induced colitis developed in animals sujected to an intense depletion of the intestinal microbiota (DSS-­¿¿PGF). Here, the administration of the GC also correlated with a sharp elevation of the disease severity, in spite of the DSS-­¿¿induced intestinal inflammation is almost completely dumpened in this experimental setting. In this experiment, on the one hand we confirmed that the negative impact of the budesonide in the disease evolution was not due to an uncontrolled bacterial translocation and a septic shock elicited by that phenomenon. On the other hand we found an evident increase of the rectal bleeding in those colitic mice exposed to budesonide and microbiologically depleted in the intestine. Coherently with this notion, we found a sharp decrease in the blood hematocrite and its hemoglobine and eritrocite concentration. In line with this impairment of the intestinal barrier function suggested by all the results described above, the in vivo intestinal permeability appeared increased by 2-­¿¿3 fold in the experimental group we are talking about, compared to the control group. This phenomenon, together with the inhibition of the mucosal epithelium restitutive response after the DSS administration, induced by the bacterial depletion which is even increased by the budesonide, as reflected by the real time PCR results regarding on the Cyclin D1 expression in colon, let us identify a massive impairment of the intestinal barrier function as the main effect underlying the deleterious consequences of the GC administration to these animals. Besides, we also found a significant reduction of the intestinal alkaline phophatase (IAP) and the leucine reach-­¿¿repeat containing G protein coupled receptor 5 (LGR5). This is of particular interest given that both are target genes for the ß-­¿¿catenin transcription factor. Besides, this result tightly correlated with an increased dickkopf-­¿¿1 (DKK1) concentration in plasma in these animals. Attending to the role of the ß-­¿¿catenin signaling in the intestine it could be an additional mechanism involved in the effects of GC in these experimental conditions. Once we had already described in detail the effects of the budesonide being administered to the animals while the induction of the acute DSS-­¿¿induced colitis is taking place, we decided to explore its effects when the administration is restricted to a few days before de DSS addition to the drinking water (DSS3). Unlike all the results described above, in this experimental approach the budesonide induced a consistent improvement of the body weight evolution and the general condition of the mice. Together with these evidences, we found a significant but mild at the same time reduction of the intestinal inflammation. This notion is reflected by the results obtained regarding on general markers like the colonic weight/length ratio and AP activity, as well as the monocyte concentration in the blood. In order to compare to the previously described experiments, it is noteworthy that unlike in those experiments in which the budesonide is administered together with the DSS, in this case it did not affected the rectal bleeding and the hemoglobine and eritrocyte concentration in the blood. Besides, we did not observe any kind of bacterial or lypopolisacharide (LPS) translocation to extra-­¿¿ intestinal tissues, which is consistent with the lack of any sign of septic shock. All these results let us confirm that the deleterious effects of the administration of budesonide, only appear if we give the GC to the mice while the DSS administration is taking place. In order to accomplish one of the main goals of this doctoral thesis, which included the analysis of the budesonide actions in a non-­¿¿chemically-­¿¿induced and T cell-­¿¿driven model of colitis, we evaluated the effects of this GC in the T cell transfer-­¿¿induced model of experimental colitis, using the GC at similar doses to those used in the DSS-­¿¿induced colitis. The administration of the budesonide to these colitic mice, even though did not generate a clear benefit on the body weight evolution, improved significantly the general condition of them because of a fairly evident local and systemic antiinflammatory effect. The analytical approaches regarding on the hallmark inflammatory markers of this model, reflect a clear dose-­¿¿dependent profile. Some of the more meaningful results come from the weight/length ratio, macroscopic fibrosis and MPO activity in colon, the concentration of Th1 cytokines in plasma, the relative abundance of CD4+ IFN¿+ cells among those obtained from MLN, the IL17A production by splenocytes after the stimulation with concanavaline A, and eventually the expression in colonic tissue of IFN¿, IL1ß, IL6, KC/CXCL1, S100A8, REG3¿ and IL17A analyzed by real time PCR. In this experiment we also studied the bacterial translocation elicited by the inflammatory response of the model itself and wether the GC modulated somehow this phenomenon. In line with bibliography, we did not observed bacterial translocation to liver and in the MLN it was 100 fold under what we found in the DSS model comparing the non-­¿¿treated colitic groups. Besides, unlike in the DSS-­¿¿induced colitis, the administration of budesonide in the T cell transfer-­¿¿induced colitis did not elicit a biologically meaningful enhancement of the bacterial translocation to none of the extra-­¿¿intestinal tissues evaluated. This is consistent with the negative results we obtained in this model regarding on the parameters that inform about septic shock when the mice received the GC. IN VITRO Studies in intestinal epithelial cells The effects of budesonide on the response of the intestinal epithelial cells (IEC4.1 and IEC18) using LPS as stimuli, was monitored by means the quantitation of chemokines in the cell culture supernatant. The results of these experiments clearly reflect an inhibitory effect of GC on this stimulation. Futhermore, attending to the graphs this inhibition follows an obvious dose-­¿¿dependent trend. In the in vitro studies in general, we assayed four GC in parallel, budesonide, dexamethasone, prednisolone and hidrocortisone. In the experiments described above, the budesonide was clearly the most powerful since its inhibitory effect got saturated with a concentrarion of 0.1 µ¿M, while considering any of the other GC it happened at a concentration between 1 and 10 µ¿M. Comparable results were obtained using peptidoglycane (PGN) as stimuli. Futhermore, the GC (mainly budesonide and dexamethasone) consistently stimulated the expression of toll-­¿¿like receptor 4 (TLR4) in IEC4.1 cells. Thus, it is not surprising the increased sensitivity to LPS that we found after the pre treatment of the cells with GC. Given that the epithelial restitution after the DSS challenge in the intestine is decisive in the animal evolution, in order to complement the findings from in vivo experiments we decided to evaluate the effects of GC on the epithelial wound healing assayed in vitro. Our results show a prominent effect of all the GC tested, by which they significantly slowed down the wound healing both, under steady-­¿¿state conditions and with the presence of stimulators of the proliferation and migration of epithelial cells like IL22, IL27 or keratinocyte growth factor. Attending to our findings that inform about an uncontrolled bacterial translocation induced by GC in the animals with acute DSS-­¿¿induced colitis, we found interesting to test in vitro wether these molecules affected the sensitivity of two murine cell lines (IEC18 and IEC4.1) to the invasion of an enteroinvasive E. coli strain, the LF82. Our results in this experiments were pretty convincing, since they reflect a consistent increase of the invasion in the cells exposed to all GC in the case of rat cell line IEC18, while strikingly it only was reproduced for the budesonide when using the mouse IEC4.1 cells but with a clear dose-­¿¿ dependent profile. Owing to the evidences already described in the in vivo section suggesting an inhibitory effect of budesonide on the Wnt/ß-­¿¿catenin signaling pathway, we decided to explore the effects of the GC on the response of IEC4.1 cells to R-­¿¿spondin-­¿¿1 (RSPO1) as stimuli. Our data resulting from this experiments reflect a weak or even the absence of any effect of the direct presence of GC on the activation of the low density lipoprotein receptor-­¿¿related protein 6 (LRP6) by RSPO1. However, in some independent experiments generating conditioned medium we tested the non-­¿¿direct effects of GC on this pathway. It'¿s pretty feasible that these effects could be mediated by the epithelial production of some soluble mediators that can develope an antagonistic action on the LRP6 receptors. In line with that hypothesis, the exposure of IEC4.1 cells to GC, prompted them to produce some still unidentified mediators that dampened the epithelial cell'¿s response to RSPO1. This theory is supported by the sharp but quite heterogeneous elevation of the DKK1 expression that we observed in IEC4.1 cells that received GC for 4 days. This result prompted us to think that this protein could mediate the indirect inhibitory effect of GC on the Wnt/ß-­¿¿catenin pathway, so we tried to detect it in the conditioned medium by ELISA. Unfortunately, we were no able to get any positive signal in any of the experimental conditions. Therefore, we can conclude that the effect described above is not exclusively attributable to DKK1 at all, but we cannot rule out the possibility that this protein contribute in some extent to that effect together with other factors. Finally, we also analyzed the effects of GC on the paracellular permeability to FITC-­dextrane, making use of monolayers of IEC4.1, IEC18 and CACO-­¿¿2 cells grown in Transwell® membranes. Strikingly, our results suggest a distinguishing behaviour of murine cell lines (IEC18 and IEC4.1) and the human one (CACO-­¿¿2). While the treatment of the murine monolayers with GC for 48 hours reduced consistent and dose-­¿¿dependently the presence of the fluorescence probe in the basolateral compartment compared to the Control group (probable owing to the undifferentiated condition of these cells in the steady-­¿¿state), considering the human cell line we got contrary results. Besides, the increased paracellular permeability associated with the exposure of CACO-­¿¿2 cells to GC was even more prominent as the cells were more differentiated, which could related with the increasing expression of the glucocorticoid receptor by these cells as they differentiate. Studies in antigen presenting cells and CD4+ T cells There are many already published articles that extensevely describe the immunomodulatory (mainly immunosuppressive) effects of the GC on the different cell types included in the gastrointestinal immune system. However, in the present doctoral thesis we decided to confirm in detail how this molecules alter the production of some cytokines with a pivotal role in the physiological response to the DSS challenge, in order to reach a better understanding of the in vivo results obtained making use of the DSS model. These assays were performed using the cell types that have been already described as a relevant source of the cytokines we wanted to focuse on. These cells are above all, antigen presenting cells. This section of the results include evidences that reflect the inhibitory effect of GC on the production of cytokines like IL22, IL27 and IL6 by, dendritic cells and CD4+ T cells magnetically purified from the spleen of healthy mice, bone marrow derived dendritic cells and splenocytes. In this experiments we needed to stimulate these cells in order to get a significant production of cytokines, so as to we could measure its levels by ELISA. Thus, all the cell types cited above were boost with different stimuli like IL23, LPS, PGN or CpGDNA, but always after an exposure for 4-­¿¿6 hours to the GC. 5. CONCLUSIONS 1. Budesonide and likely glucocorticoids in general, have an interesting double sword action on the inflamed intestinal mucosa: first a consistent local antiinflammatory action, but also a negative effect related to an induction of a leaky gut state that has a negative impact on the systemic balance, namely a severe worsening of the animal condition and eventually its death. 2. Our data strongly suggest that the deleterious effects of glucocorticoids on the intestinal mucosa, take place exclusively when the intestinal epithelium is severely damaged (acute DSS-­¿¿induced colitis). Conversely, they don'¿t appeare when the glucocorticoids are used in other models of colitis in which the intestinal epithelial barrier is barely compromised, for instance the lymphocyte transfer-­¿¿induced colitis. 3. The weakening of the intestinal barrier function induced by glucocorticoids implies an enhancement of the bacterial translocation from the gut to other extra-­¿¿intestinal tissues. Our data point towards an inhibition of the immunological mechanisms in charge of the luminal bacteria containment, but also of the wound healing mechanisms of the intestinal epithelium as the underlying reason for this phenomenon. 4. In vitro studies developed on intestinal epithelial cells point to certain differences among the different glucocorticoids in terms of the modulation of the epithelial cell'¿s invasion by enteroinvasive bacteria, cytokine release after stimulation with different PAMP and epithelial wound healing, even though more experiments are needed to clarify this diverging behaviour. Actually, during the last year of experimental work oriented to this thesis we have developed a transgenic mouse with inducible ablation of the glucocorticoid receptor in the intestinal epithelial cells. This tool will help us shedding light on the relative relevance of this cell type in the effects of locally produced and exogenous glucocorticoids on the acute DSS-­induced colitis described in this work, but also on its role in the intestinal homeostasis both under steady-­¿¿state and other inflammatory conditions. 5. Our results could have some implications regarding on the clinical management of IBD patients making use of glucocorticoids with local or systemic distribution, particularly if the disease is featured by a sharp increase of the intestinal permeability and/or bacterial translocation. Besides, many investigators are pointing to the intestinal barrier dysfunction as a critical factor in the establishment of other diseases like the metabolic syndrome. Thus, our results suggest that the indication of glucocorticoids like budesonide in patients with that medical condition could be controversial.