Interacciones cooperativas y efectos contextuales en dominios sh3 y ww

Resumen

INTERACCIONES COOPERATIVAS Y EFECTOS CONTEXTUALES EN DOMINIOS SH3 y WW INTRODUCCIÓN Las proteínas juegan un papel importante en la mayoría de los procesos biológicos celulares ya que desempeñan un gran número de funciones: son elementos estructurales que ayudan a mantener la integridad de la célula, conectan diferentes elementos dentro de ella, son responsables de la regulación y el transporte de nutrientes y generan, transforman y transfieren impulsos nerviosos, entre otras muchas más funciones (Pawson, 1995). Dentro del contexto funcional, las proteínas establecen una compleja red de interacciones que es crucial para el correcto funcionamiento celular. Cualquier distorsión de esta red puede traducirse en serias alteraciones de las funciones celulares que originan el desarrollo de numerosas enfermedades. Por este motivo, una comprensión profunda y detallada de estas interacciones nos permitirá predecir y modular la respuesta fisiológica o incluso patológica de la célula a un estímulo específico y facilitará el desarrollo de estrategias racionales de diseño molecular que conduzcan a la obtención de nuevas proteínas con funciones y estabilidades deseadas o al desarrollo de nuevos fármacos. Los procesos de reconocimiento proteína-proteína a través de los cuales se organiza y coordina todo el ciclo de vida celular se establecen a veces gracias a unos pequeños dominios modulares que reconocen secuencias específicas en sus proteínas diana y están altamente conservados y presentes en diversas proteínas. Dentro de los diferentes tipos de dominios modulares, los más ampliamente representados en el genoma humano son los que reconocen secuencias ricas en prolina (Macias et al, 2002). Estos dominios son de pequeño tamaño (entre 20 y 150 aminoácidos) y se caracterizan por tener uno o más sitios de unión. Las distintas familias de dominios son estructuralmente diferentes y reconocen pequeñas secuencias de entre 3 y 6 aminoácidos, específicas y muy conservadas, en sus proteínas diana. Estas secuencias características están flanqueadas por aminoácidos adicionales que interaccionan con elementos variables del sitio de unión del dominio y que parecen ser responsables de la especificidad de unión dentro de cada familia de dominios. Las interacciones de estos dominios con las secuencias ricas en prolina presentan afinidades moderadas o bajas, cuyas constantes de disociación varían entre 1 y 500 µM. Además, se postula que las divergencias entre los dominios de una misma familia son suficientes para establecer redes de interacciones de alta especificidad (Zarrimpar et al. 2003). Sin embargo, se ha detectado un elevado grado de promiscuidad para algunos de estos dominios puesto que reconocen un número considerable de dianas con afinidades comparables. A la vista de esta aparente paradoja se ha propuesto la existencia de dos tipos de especificidad: una especificidad intrínseca encriptada en cada pareja de dominio-ligando y una especificidad contextual en la que factores como la localización subcelular o el efecto cooperativo de interacciones múltiples desempeñan un papel importante (Ladbury and Arold 2000, Mayer 2001). Actualmente se conocen hasta cinco familias de este tipo de dominios, que son los dominios SH3, WW, EVH1, GYF y UEV. En esta tesis hemos centrado el estudio en los dominios SH3 y WW (Ball et al. 2005). Los dominios SH3 reconocen ligandos que contienen la secuencia canónica xPxxP adoptando una conformación en hélice de poliprolina II en el complejo. Actúan generalmente como sitios de anclaje para el reclutamiento de sustratos y la formación de complejos supramoleculares que conducen a la modificación enzimática de algunos componentes. En ocasiones desempeñan un papel esencial en la regulación de la actividad enzimática de las proteínas que los contienen mediante el establecimiento de interacciones intramoleculares con otros elementos (Arold et al, 2001). Este es el caso de las quinasas de tirosina de la familia Src que están claramente relacionadas con el desarrollo de procesos cancerígenos y están implicadas en patologías como el SIDA, la leucemia, la osteoporosis y otros procesos inflamatorios, alérgicos y asmáticos (Dalgarno et al, 1997). Los dominios WW estudiados en esta tesis reconocen la secuencia consenso PPxY, que es el modo de unión más común en estos dominios. La unión de los dominios WW a sus dianas naturales está relacionada con funciones muy variadas como la transcripción del ADN, el procesamiento del ARN, el reconocimiento de ubiquitina, el tráfico de proteínas y de receptores de señalización y el control del citoesqueleto (Sudol et al. 2001). Por tanto, algunas alteraciones de la funciones de los dominios WW se han relacionado con varias enfermedades humanas como el síndrome de hipertensión de Lyddle, la distrofia muscular, procesos cancerígenos y las enfermedades de Alzheimer y de Huntington. Además, algunos dominios WW están implicados en el desarrollo de infecciones víricas, como el Ébola o la leucemia humana (Bellomaria et al. 2010; Timmins et al. 2003). En esta tesis se quiere demostrar que a través del análisis termodinámico del equilibrio conformacional y de la interacción de los módulos de reconocimiento de prolina con sus ligandos tenemos información sobre la cooperatividad y la influencia de otros elementos tanto extrínsecos como intrínsecos lo que nos permite evaluar los efectos contextuales en la especificidad de unión y en la afinidad proporcionando información relevante para el diseño racional de inhibidores con función terapéutica. DESARROLLO TEÓRICO La investigación propuesta durante este trabajo ha sido llevar a cabo el análisis termodinámico y estructural de los determinantes moleculares en la especificidad y afinidad de unión, enfocándolo en la evaluación del impacto de efectos contextuales en la unión y la cooperatividad. En primer lugar analizamos las bases moleculares de la comunicación intramolecular en el dominio cSrc-SH3 utilizando el conjunto de estructuras de RMN del complejo con el péptido RLP2 como punto de partida para el análisis. Para ello iniciamos una colaboración con el Dr. Tom Lenaerts de la Universidad Libre de Bruselas, que ha desarrollado un análisis computacional usando la teoría de la información para tratar de identificar y predecir las redes de transmisión de información en este dominio. En nuestro laboratorio realizamos la validación experimental, para lo que obtuvimos una serie de 15 mutantes usando métodos de mutagénesis dirigida, llevamos a cabo las correspondientes pruebas de expresión y los purificamos mediante cromatografía de afinidad Ni-NTA. Una vez que purificados los distintos mutantes evaluamos el impacto de las mutaciones en la estabilidad estructural y las propiedades conformacionales del dominio cSrc-SH3 por lo que se caracterizamos el proceso de desplegamiento mediante Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC). Una vez que confirmamos que los distintos mutantes del domino cSrc-SH3 se encontraban correctamente plegados, estudiamos el impacto de estas mutaciones en la energética de unión. Para obtener una constante de unión aproximada realizamos los experimentos de titulación por espectroscopía de fluorescencia así poder diseñar los experimentos de Calorimetría Isotérmica de Titulación (ITC) y poder obtener un patrón termodinámico completo. Todos los datos se analizan a través del programa Origin 7.0. Por otro lado evaluamos la existencia de cooperatividad estructural entre los distintos módulos de la quinasa Abl. En primer lugar obtuvimos los clones de distintas construcciones de la quinasa, hicimos pruebas de expresión y llevamos a cabo su purificación. A través de experimentos de DSC abordamos la caracterización del equilibrio conformacional de las construcciones AblSH2SH3 y AblSH2SH3-C2Q proporcionándonos información relevante sobre la cooperatividad en estos sistemas y de su conexión con el papel regulador de la actividad catalítica en el contexto de la quinasa completa. También estudiamos la influencia de la secuencia de conexión entre ambos dominios mediante la introducción de mutaciones usando la técnica de mutagénesis dirigida. Realizamos diferentes pruebas de expresión de estos mutantes para su posterior purificación y llevamos a cabo los mismos experimentos de DSC que en el caso de las construcciones silvestres. Por último hemos estudiado el equilibrio conformacional, cooperatividad e interacción de diferentes ligandos con los cuatro dominios WW que componen la ligasa de ubiquitina humana Nedd4, tanto de forma aislada como en diferentes construcciones en tándem. Así, caracterizamos mediante DSC el equilibrio conformacional de cada uno de los dominios WW y cómo éste se ve modulado, por la presencia de dominios adicionales en tándem, con el fin de investigar la existencia de cooperatividad estructural entre los diferentes dominios WW de Nedd4. También ha sido nuestro objetivo abordar el estudio de las reglas que gobiernan la especificidad de unión en los diferentes dominios WW de Nedd4, identificando aquellos rasgos que confieren especificidad intrínseca en las secuencias virales. Para ello medimos la energética de unión a través de ITC de los cuatro dominios WW de Nedd4, tanto aislados como en tándem para evaluar el impacto de dominios adicionales en la interacción con dominios L víricos como el Ébola, la proteína celular M1 y el ligando de alta afinidad UGR-1, que hemos identificado mediante la técnica de expresión en fagos. CONCLUSIONES ¿ A través de estudios computacionales y termodinámicos hemos identificado un patrón de residuos en el dominio SH3 de cSrc que está implicado en la transmisión de información desde el sitio de unión hasta otras regiones del dominio. Estos residuos se pueden dividir en dos grupos, uno que influye sobre la estabilidad del dominio y otro funcional, que tiene efecto sobre la afinidad del ligando. ¿ Del análisis del equilibrio conformacional del tándem de los dominios SH2 y SH3 de cAbl hemos descubierto la importancia de la secuencia conectora entre el dominio SH2 y el dominio quinasa, ya que en ausencia de otro elemento de la quinasa, reconfigura el espacio conformacional del tándem, haciendo que la forma cerrada sea la más estable y ayudando a que la proteína permanezca en su forma inhibida. Además, la secuencia que conecta los dominios SH2 y SH3 es el responsable de limitar la entropía conformacional del tándem de dominios modulares, otorgándoles suficiente libertad para que el dominio SH3 se desplace para reconocer ligandos y liberar el dominio catalítico. ¿ Los resultados de nuestro trabajo con los dominios WW de Nedd4 indican que los dominios asilados muestran una estabilidad marginal, con rasgos de plegamiento downhill en su equilibrio conformacional, que no se ve alterado significativamente por la presencia de otros dominios WW en tándem. BIBLIOGRAFÍA ¿ Arold, S.T. et al. (2001) The role of the Src homology 3-Src homology 2 interface in the regulation of Src kinases. J Biol Chem 276, 17199-205 ¿ Ball LJ, Kuhne R, Schneider-Mergener J, Oschkinat H (2005) Recognition of proline-rich motifs by protein-protein interaction domains. Angew Chem Int Ed Engl 44: 2852-2869 ¿ Bellomaria A, Barbato G, Melino G, Paci M, Melino S (2010) Recognition of p63 by the E· ligase ITCH: Effect of an ectoderml dysplasia mutant. Cell Cycle 9: 3730-3739 ¿ Dalgarno DC, Botfield MC, Rickles RJ (1997) SH3 domains and drug design: ligands, structure, and biological function. Biopolymers 43 (5): 383-400 ¿ Ladbury JE, Arold S (2000) Searching for specificity in SH domains. Chem Biol 7:R3-8 ¿ Macias MJ, Wiesner S, Sudol M (2002) WW and SH3 domains, two differente scaffolds to recognize proline-rich peptide. FEBS Lett 513: 30-37 ¿ Mayer, B.J. (2001) SH3 domains: complexity in moderation. J Cell Sci 114, 1253-63 ¿ Pawson, T (1995) Protein modules and signalling networks. Nature 373, 573-80 ¿ Sudol M, Sliwa K, Russo T (2001) Functions of WW domains in the nucleus. FEBS Lett 490: 190-195 ¿ Timmis J, Schoenhn G, Ricard-Blum S, Scianimanico S, Vernet T, Ruigrok RW, Wissenhorn W (2003) Ebola virus matrix protein VP40 interaction with human cellula rfactors Tsg101 and Nedd4. J Mol Biol 326: 493-502 ¿ Zarrimpar A, Park SH, Lim WA (2003) The structure and function of proline recognition domains. Sci STKE 2003: RE8