Genómica funcional de transportadores MDR bacterianos en infecciones de plantas

Resumo

Los microorganismos están expuestos a diversos compuestos con actividad antimicrobiana como son los antibióticos semisintéticos o biocidas, desarrollados específicamente para el tratamiento de agentes infecciosos, compuestos orgánicos e inorgánicos producto de la actividad industrial, agrícola y urbana, compuestos tóxicos generados por las plantas frente al ataque de patógenos, etc. Todos estos compuestos actúan sobre la pared celular, la membrana citoplasmática o sobre rutas biosintéticas esenciales para el crecimiento bacteriano; sin embargo, existen bacterias resistentes a la acción de los mismos gracias a mecanismos protectores especiales. El método más efectivo y extendido de resistencia microbiana es la eliminación de compuestos tóxicos mediante transportadores de amplio espectro en un proceso dependiente de energía, que reducen así su concentración intracelular a niveles sub-tóxicos. Estos transportadores pueden ser específicos para un sustrato o pueden transportar una gama de compuestos estructuralmente diferentes. Estos últimos están asociados a la multirresistencia (MDR, multidrug resistance) y tienen una gran importancia clínica, ya que provocan infecciones bacterianas intratables, pero también se encuentran en bacterias del suelo y en aquellas asociadas a plantas. Existen cinco familias de transportadores MDR bacterianos, que se clasifican en varias familias según su modo de acción y los sustratos que exportan: ABC (ATP binding cassette), MFS (major facilitator superfamily), MATE (multidrug and toxic compounds extrusion), SMR (small multidrug resistance) y la superfamilia RND (resistance, nodulation and cell-division). Cada vez hay más evidencias de que los transportadores bacterianos que confieren multirresistencia son importantes en virulencia. Así, se han descrito en bacterias patógenas de animales y humanos algunos transportadores que no sólo expulsan antibióticos sino también compuestos antimicrobianos producidos por el hospedador, lo que permite a la bacteria sobrevivir en su nicho ecológico. Además, algunos transportadores pueden exportar también determinantes de virulencia, como adhesinas, toxinas u otras proteínas importantes para la colonización y la infección de células humanas y animales, y su mutación limita su virulencia. Las bacterias fitopatógenas también poseen transportadores MDR que confieren resistencia a compuestos tóxicos producidos por la planta hospedadora, lo que favorece la invasión y el desarrollo de la enfermedad. Las bacterias Gram-negativas pertenecientes al complejo Pseudomonas syringae constituyen un grupo de patógenos de gran importancia económica y agrícola, ya que infectan una gran variedad de plantas, tanto herbáceas como leñosas, causando síntomas diversos: moteados y necrosis en hojas, podredumbre de frutas, tumores en tallos y chancros, entre otros, dependiendo del tipo de planta y del sitio de la infección. En esta tesis doctoral se han utilizado dos cepas modelo: P. syringae pv. phaseolicola 1448A (Pph), agente causal de la grasa de la judía (Phaseolus vulgaris), una enfermedad sistémica cuyos síntomas son lesiones acuosas rodeadas de un halo clorótico que acaban provocando la necrosis del tejido, tanto a nivel de fruto como de hoja, y P. syringae pv. tomato DC3000, agente causal de la mancha negra del tomate y patógeno de la planta modelo A. thaliana. Este trabajo se centró en el estudio de varios transportadores MDR: MexAB-OprM de Pph 1448A, TpsABC de Pto DC3000 y MatE de Pto DC3000. Estos transportadores se estudiaron con el fin de caracterizarlos funcionalmente mediante técnicas moleculares con objeto de determinar su papel fisiológico y su implicación en los procesos infectivos y analizando mediante fluorescencia multicolor la respuesta de la planta frente a la enfermedad desarrollada por la bacteria en cada caso. En resumen, los resultados obtenidos en este trabajo de tesis demuestran que el transportador MexAB-OprM Pph 1448A está implicado en su resistencia intrínseca a múltiples antibióticos, biocidas, agentes mutagénicos y, en especial, a varios flavonoides, por lo que contribuye a la colonización de las hojas de judía por Pph 1448A y le permite competir eficientemente en su nicho ecológico. En cuanto al transportador TpsABC de Pto DC3000, se determinó que se expresa desde un operón que codifica dos proteínas de fusión (MFPs) y que su inactivación no afecta la capacidad de Pto DC3000 para colonizar ni para invadir las plantas de tomate, pero sí a su capacidad para provocar los síntomas de la enfermedad, indicando que podría tener un papel en la virulencia de esta bacteria. Por último, la eliminación del transportador MatE en Pto DC3000 disminuye la capacidad de esta bacteria para producir síntomas en plantas de tomate, por lo que posiblemente tiene un papel en virulencia. Finalmente, utilizamos la técnica de captación de imágenes de fluorescencia multiespectral (multicolor fluorescence imaging, MCFI) inducida por iluminación UV para detectar el efecto de las distintas cepas mutantes en los transportadores estudiados sobre la planta hospedadora. La excitación de una hoja en el rango UV-A (¿= 355 nm) conduce a la emisión, no sólo de fluorescencia roja y en el rojo lejano (Chl-FI, 690 y 740 nm), sino también azul y verde (BGF, 440 y 520 nm). La primera está ligada a la concentración de clorofila foliar y la BGF, a distintos fenoles, polifenoles y fenilpropanoides. Aumentos en las emisiones de F440 y F520 se corresponden con una activación del metabolismo secundario para la producción de estos metabolitos de defensa en la planta hospedadora. Los cambios en los patrones foliares de F440 y F520 observados tras la infección con los mutantes en los transportadores reflejaron los cambios en virulencia de éstos y ofrecieron la posibilidad de un diagnóstico presintomático de la infección, resultando ser F520 un parámetro especialmente sensible. Bina, X.R., Provenzano, D., Nguyen, N. y Bina, J.E. 2008. Infect. Immun. 76: 3595-3605. Brown, M.H., Paulsen, I.T. y Skurray, R.A. 1999. Mol. Microbiol. 31: 394-395. 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