Regulación por micorrizas arbusculares de la fisiología y las acuaporinas de maíz (zea mays l.) en relación con la tolerancia de la planta hospedadora al déficit hídrico

Resumen

INTERÉS CIENTÍFICO DEL PROYECTO La correcta utilización y explotación del potencial de la simbiosis MA en el contexto de una moderna agricultura sostenible se considera de vital importancia y requiere de una investigación básica apropiada. Esta investigación contribuirá a mejorar el desarrollo vegetal en ambientes afectados por sequía como las zonas semiáridas de la cuenca mediterránea en las que la disponibilidad de agua para la planta es limitada, así como a incrementar la producción agrícola desde la perspectiva de la conservación del medio ambiente y el uso integral del territorio. En la actualidad, se siguen desconociendo muchos de los mecanismos por los que la simbiosis MA altera la respuesta de la planta frente al déficit hídrico y mejora su tolerancia al mismo. La simbiosis micorrícica protege a la planta frente a los efectos del déficit hídrico actuando sobre cinco aspectos fundamentales de su fisiología: las relaciones hídricas de la planta, la fotosíntesis, la osmoregulación, la regulación hormonal (especialmente la del ABA) y los sistemas antioxidantes. Muchos de estos efectos tienen una clara relación con la expresión, acumulación y/o actividad de las acuaporinas, ya que éstas aparecen involucradas en todos los procesos relacionados con las propiedades hídricas de las plantas. Además, el descubrimiento de un número cada vez mayor de moléculas diversas con importancia fisiológica para las plantas cuyo transporte ocurre a través de las acuaporinas abren las puertas a una nueva forma de entender la relevancia de estas proteínas, convirtiéndose en punto clave en el estudio fisiológico y molecular del funcionamiento de las plantas y su respuesta al estrés hídrico. El presente estudio pretende combinar e integrar los estudios fisiológicos con los bioquímicos y moleculares para elucidar cómo las micorrizas modifican esos aspectos fisiológicos fundamentales de la resistencia al estrés hídrico y cómo se relacionan con el control de las acuaporinas. Con este estudio, se pondrán las bases que permitan obtener un máximo rendimiento de la simbiosis MA bajo condiciones ambientales de limitación hídrica y permitirá, también, una futura manipulación de los genes de acuaporinas a fin de obtener plantas más resistentes a dicho estrés. La regulación de la tolerancia al estrés hídrico de las plantas micorrizadas está altamente relacionada con el control de las actividades osmoreguladoras y antioxidantes de las mismas. Los estudios llevados a cabo hasta la fecha presentan variaciones en los resultados en función de los compuestos analizados y de la parte concreta de la planta considerada en el análisis (Ruiz-Lozano, 2003; Porcel et al., 2003 y 2004; Ruiz-Sánchez et al., 2010; Bheemareddy y Lakshman, 2011; He et al., 2011). Así pues, en primer lugar encontramos necesario elucidar si el efecto de la micorrización sobre estos sistemas de protección se produce sólo a nivel local o de manera sistémica a nivel de toda la planta, para tratar así de entender la base de tales contradicciones. Para ello se llevó a cabo el análisis de los procesos bioquímicos y compuestos implicados en estos sistemas de protección utilizando un sistema de raíces divididas (¿Split root system¿) que permite aplicar distintos tratamientos a distintas zonas de la raíz y analizar sus efectos en los distintos compartimentos radicales y parte aérea. También tratamos de obtener información sobre el control de la presencia y actividad de las acuaporinas más importantes relacionadas con el estatus hídrico de la planta (Javot et al., 2003; Katsuhara et al., 2008), ya que muchos estudios apuntan a que el control del transporte de agua a través de las acuaporinas puede ser el que condicione la conductancia hidráulica total de la planta micorrizada (Marjanovic et al., 2005; Lee et al., 2010) pudiendo ser aún más relevante su contribución en condiciones de sequía (Aroca et al., 2007; Ruiz-Lozano y Aroca, 2010). Para ello hemos analizado la presencia en membranas de los subgrupos de acuaporinas más importantes relacionados con el transporte de agua en las plantas, las PIPs1 y las PIPs2. La permeabilidad de las PIPs está además controlada por mecanismos de regulación que permiten una adaptación rápida a los frecuentes cambios ambientales. Para llevar a cabo esta rápida regulación, las modificaciones post-traduccionales parecen ser claves (Vandeleur et al., 2014). La de-fosforilación de residuos de serina ocurre habitualmente en condiciones de estrés hídrico (Johansson et al., 1996; 1998) y produce el cierre de las acuaporinas (Törnroth-Horsefield et al., 2006). Por ello hemos querido analizar también la presencia de PIPs2 fosforiladas en la S115 (en el lazo B) y en la S274 (en la región C-terminal), ambas altamente conservadas en todas las PIPs2 de maíz. En segundo lugar, los estudios llevados a cabo hasta la fecha sugieren que el ácido abcísico (ABA) podría ser fundamental en la regulación de la respuesta al estrés a nivel de toda la planta (Zhang et al., 2006; Hirayama y Shinozaki, 2007). Se ha puesto de manifiesto la fuerte influencia que la simbiosis MA puede tener sobre el contenido y la regulación de la señal generada por ABA en condiciones de estrés hídrico, ya que ambos factores parecen influir sobre los mismos procesos y mecanismos de tolerancia al estrés en plantas (Ruiz-Lozano et al., 2006; Aroca et al., 2008a y 2008b). Tanto el ABA como la simbiosis MA afectan especialmente a las relaciones hídricas de la planta, en las que las acuaporinas juegan un papel fundamental (Porcel et al., 2006; Aroca et al., 2007; Jahromi et al., 2008). Así pues, hemos analizado en detalle el efecto combinado de la simbiosis MA y de la aplicación de ABA sobre plantas sometidas a estrés hídrico y tras su recuperación del mismo y hemos estudiado la relación que existe entre ambos factores y la regulación de las acuaporinas. En tercer lugar, dados los efectos de la micorrización sobre las propiedades hidráulicas de la planta, y dada la controversia que existe acerca de las implicaciones que las distintas vías de transporte de agua (apoplástica y célula a célula) pueden estar jugando en el transporte total de agua en la planta en condiciones de sequía (Voicu et al., 2009; Knipfer y Fricke, 2010; Fritz y Ehwald, 2011), encontramos imprescindible determinar claramente la influencia de la micorrización sobre las distintas vías de transporte de agua en la planta en condiciones de riego óptimo y de estrés hídrico, utilizando dos variedades de plantas agrícolas diferentes, el maíz y el tomate. Para ello llevamos a cabo dos experimentos diferentes: uno destinado al análisis del porcentaje de agua que circula por la vía apoplástica en plantas MA y no MA en condiciones óptimas y de sequía, y otro basado en la utilización de un inhibidor de acuaporinas (y por tanto de la vía célula a célula) que nos permiten analizar la respuesta de las plantas cuando alteramos la disponibilidad de la vía de transporte de agua célula a célula. Por último y puesto que las acuaporinas parecen estar implicadas en un amplio rango de procesos fisiológicos de las plantas, hemos determinado, tanto en condiciones óptimas como de sequía, de qué forma la simbiosis MA modula la totalidad de las acuaporinas presentes en la planta. Hay poca información sobre la influencia de la simbiosis MA sobre las acuaporinas y los resultados obtenidos son en algunos casos contradictorios (Aroca et al., 2007, 2008b). Esto es debido a que la importancia de estas proteínas como canales de membrana para un importante número de compuestos sólo se ha puesto de manifiesto en los últimos años. No obstante, dado que en plantas las acuaporinas constituyen una familia multigénica (Chaumont et al., 2001) y que cada gen parece tener una actividad específica dependiendo del tejido en que se expresa y de las condiciones ambientales (Valot et al., 2005), hemos considerado necesario determinar la influencia de la simbiosis MA sobre la expresión de todos y cada uno de los genes de acuaporinas del maíz para poder identificar así aquellos genes que resulten claves en la respuesta de la planta micorrizada al déficit hídrico. Hemos analizado también, mediante técnicas de expresión heteróloga, su capacidad para transportar diversos solutos que puedan tener una influencia en la diferente respuesta de las plantas MA con respecto a las plantas no MA. Por último, estudiamos la presencia y localización subcelular de aquellas que resulten más relevantes en estas condiciones. Puesto que hemos visto que las especies implicadas en la simbiosis definen las bases de las respuestas al estrés impuesto y que, por ello, los resultados no son extrapolables a otras especies, hemos querido utilizar para este proyecto de investigación una de las plantas de mayor interés agrícola, el maíz (Zea mays L.), que constituye la fuente de alimento básica para millones de personas en todo el mundo (Heng et al., 2009) y cumple, además, varios requisitos indispensables para abordar este proyecto: 1.- Es una planta micotrófica en la que se alcanzan elevados niveles de colonización (Boomsma y Vyn, 2008). 2.- En pruebas previas, esta planta ha mostrado ser sensible al estrés hídrico y a la micorrización, mostrando variaciones fisiológicas claras y siendo adecuada para las medidas de las relaciones hídricas y sistemas de protección frente al estrés (Boomsma y Vyn, 2008). 3.- Se han descrito ya todas las acuaporinas presentes en su genoma (Chaumont et al., 2001). Como simbionte fúngico hemos escogido uno de los más extendidos en todos los ecosistemas terrestres, el hongo MA Rhizophagus intraradices, anteriormente conocido como Glomus intraradices, que cumple varios requisitos indispensables: 1.- Es un hongo MA de baja especificidad, tanto en hospedadores como en hábitats. 2.- Tiene alta capacidad infectiva incluso en suelos degradados o sometidos a laboreo. 3.- Genera efectos fenotípicos claramente visibles en el hospedador tanto en condiciones óptimas como en situaciones de estrés. RESULTADOS Y DISCUSIÓN En esta tesis doctoral hemos profundizado en el conocimiento de las respuestas de las plantas micorrizadas al déficit hídrico y hemos comprobado que las acuaporinas juegan un papel fundamental en muchos de los procesos de respuesta al estrés hídrico de las plantas MA. Osmoregulación La acumulación de compuestos osmoreguladores como azúcares solubles y prolina es un mecanismo destinado a proteger los tejidos de las plantas de los efectos de la deshidratación, ya que consigue disminuir el potencial de solutos (¿s) favoreciendo la entrada de agua hacia las células. La acumulación de azúcares solubles en condiciones de sequía mostró tener un efecto sistémico, afectando a ambos compartimentos de la raíz y a la parte aérea. En cualquier caso, la acumulación de azúcares solubles en hojas de plantas micorrizadas fue menor que en las no micorrizadas. Este efecto ha sido descrito en diversos estudios que apuntan a un mayor metabolismo en las plantas MA (Subramanian et al., 1997). De hecho, concuerda con los datos fisiológicos, que apuntan a que las plantas MA mantienen durante más tiempo los procesos de desarrollo y crecimiento, siendo este efecto mayor cuanto mayor es el grado de micorrización de la planta. La acumulación de prolina y azúcares en las raíces sometidas a sequía se ha interpretado como un mecanismo para conseguir mantener el flujo de entrada de agua cuando el potencial hídrico del suelo disminuye (Porcel et al., 2004). En este sentido, las raíces de las plantas micorrizadas presentaron mayor acumulación de azúcares y prolina cuando ambos compartimentos estaban sujetos a sequía, lo que sugiere una capacidad de ajuste osmótico mayor que en las raíces de plantas no MA bajo estas condiciones. Por otro lado, el presente estudio revela que la acumulación de prolina en raíces, a diferencia de la acumulación de azúcares solubles, funciona a nivel local, lo que podría explicar los resultados contradictorios encontrados hasta la fecha. Así pues, cuando la sequía afecta solo a ciertas zonas del suelo, la acumulación de prolina tiene un efecto local, funcionando por igual en plantas micorrizadas y no micorrizadas, pero cuando el estrés se acentúa tiene un efecto sistémico en plantas MA, afectando y protegiendo a toda la planta de los efectos de la deshidratación gracias a su mayor capacidad de osmoregulación, mediante una mayor acumulación de este soluto compatible. Sin embargo, en hojas encontramos efectos muy diversos. En primer lugar, la sequía aplicada a uno solo de los compartimentos radicales (sequía no fisiológica) no generó un aumento de estos compuestos en hojas y, en condiciones de estrés hídrico moderado, la simbiosis MA contuvo el incremento en prolina, que sólo aumentó en las plantas no MA. Sin embargo, en condiciones de estrés más severo (afectando a toda la raíz) las plantas MA alcanzaron un nivel mayor de prolina y de azúcares solubles en hojas que las plantas no MA. Esto sugiere que las plantas MA consiguen evadir durante más tiempo el efecto negativo del estrés hídrico sobre su parte aérea, pero una vez que el estrés se acentúa y alcanza la parte aérea, estas plantas tienen una mayor capacidad de producción y acumulación de estos compuestos. El conjunto de estos datos podría explicar los resultados contradictorios sobre osmoregulación en plantas MA encontrados hasta la fecha (Porcel y Ruiz-Lozano, 2004; Porcel et al., 2004), ya que los efectos que la simbiosis MA tiene sobre los mecanismos osmoreguladores de la planta dependen en gran medida de la intensidad del estrés impuesto. Sistemas antioxidantes Las plantas sometidas a estrés hídrico presentan un aumento en la acumulación de especies reactivas del oxígeno (ROS), que generan un estrés oxidativo secundario en sus tejidos (Kramer y Boyer, 1995; Miller et al., 2010). Este efecto puede detectarse por el estudio del daño oxidativo a lípidos de membrana (DOL). Se ha visto que las plantas micorrizadas presentan menor DOL en condiciones de estrés hídrico que las plantas no MA (Ruiz-Lozano et al., 2001; Porcel et al., 2003). De hecho, los resultados obtenidos revelaron que los niveles de DOL no aumentaron en las plantas micorrizadas sometidas a sequía, y el aumento en las plantas con raíz parcialmente micorrizadas fue (en porcentaje) menor que en las plantas no micorrizadas. Además, las zonas micorrizadas de la raíz acumularon más glutatión a nivel local y menos ascorbato reducido, lo que en conjunto dio lugar a una menor acumulación de peróxido de hidrógeno (H2O2) en respuesta al estrés hídrico. Ello indica que las raíces micorrizadas tienen un sistema antioxidante más eficiente (Talaat y Shawky, 2011). De hecho, los efectos diferenciales en el daño oxidativo encontrados entre las plantas sometidas a sequía parcial nos indican claramente que cuando la sequía afectó a los compartimentos micorrizados, el daño tuvo un efecto localizado, restringiéndose a esa zona de las raíces pero manteniéndose en niveles normales en el resto de la planta. Por el contrario, cuando la sequía afectó a raíces no MA, la utilización y consiguiente disminución del ascorbato reducido no fue suficiente para evitar la acumulación de H2O2 a nivel local en estas raíces, a pesar de una mayor actividad de la enzima Ascorbato peroxidasa (APX), por lo que se generó un DOL mayor que afectó a toda la planta por igual. De hecho, las plantas no micorrizadas sometidas a sequía parcial no fisiológica mostraron el mismo comportamiento que las sometidas a sequía total y fisiológica, demostrando más dificultades para enfrentarse al estrés hídrico desde el comienzo del mismo. Esto mismo. Por el contrario, las plantas plenamente micorrizadas sometidas a sequía parcial consiguieron evadir el estrés hídrico en su parte aérea, manteniendo todos sus parámetros fisiológicos, así como los sistemas de protección osmóticos y antioxidantes, a niveles similares a los de las plantas cultivadas en condiciones óptimas. Ajuste hormonal: Ácido abcísico Las simbiosis MA modula los mismos procesos fisiológicos que el ABA, mejorando la tolerancia al estrés hídrico (Ruiz-Lozano, 2003) y, aunque hasta la fecha se han llevado a cabo pocos estudio sobre la influencia combinada de ambos factores sobre las propiedades hidráulicas en plantas sometidas a estrés hídrico, sabemos que existe una fuerte relación entre la respuesta a la simbiosis MA y el contenido de ABA endógeno de la planta hospedadora, así como una diferente regulación del contenido en ABA en plantas MA y no MA (Aroca et al., 2008 a y b). Los resultados de esta tesis mostraron que el contenido en ABA de las plantas de maíz no MA fue mayor que el de las plantas MA tanto en condiciones de sequía como tras su recuperación y se ha propuesto que las plantas MA pueden acumular menos ABA que las plantas no MA como consecuencia de la existencia de mecanismos primarios de evitación del estrés (Porcel et al., 2005; Ruiz-Lozano et al., 2006), como los explicados en los apartados anteriores. Además, estudios previos sugerían que las plantas MA regulan mejor y más rápido sus niveles de ABA que las plantas no MA (Aroca et al., 2008b). En paralelo a estos resultados, los valores de conductancia hidráulica osmótica radical (Lo) de las plantas MA fueron menores que los de las plantas no MA, especialmente cuando se aplicó ABA exógeno, que acentuó las diferencias de Lo entre ambos tipos de plantas, por lo que existe una evidente relación entre los niveles de ABA en plantas MA y no MA y sus efectos sobre Lo. Por otro lado, encontramos que la aplicación de ABA exógeno aumentó Lo en todas las plantas independientemente del tratamiento de riego aplicado. La regulación de la conductancia radical ha sido relacionada directamente con cambios en la presencia y actividad de las acuaporinas (Javot y Maurel, 2002; Luu y Maurel, 2005; Beaudette et al., 2007) por lo que se ha propuesto que la función de las acuaporinas y la señal de transducción del ABA puedan estar interconectadas (Kaldenhoff et al., 2008). En este estudio, también observamos que el efecto de ABA sobre la expresión de los genes de PIPs depende de la presencia o ausencia del hongo MA. Así pues, la diferente regulación del contenido en ABA por la simbiosis MA podría estar modificando Lo a través del control de las acuaporinas. De hecho, las modificaciones en Lo, especialmente en plantas suplementadas con ABA exógeno, están claramente relacionadas con la expresión de la mayor parte de las PIPs analizadas. También es remarcable el importante incremento en Lo y la expresión de las siete PIPs analizadas en plantas no MA sometidas a recuperación tras un periodo de sequía al aplicarles ABA exógeno, mientras que las correspondientes plantas MA mostraron una clara reducción de Lo en paralelo a la reducida expresión de las PIPs. Una disminución de la expresión génica de PIPs en plantas MA sometidas a estrés hídrico ha sido interpretada habitualmente como un mecanismo conservativo que evita la pérdida de agua de las células (Porcel et al., 2006; Jang et al., 2007) y el fino control ejercido por las simbiosis MA sobre las acuaporinas de la planta hospedadora puede ser crucial en condiciones de estrés hídrico. En su conjunto, todos estos resultados sugieren que la combinación de ABA exógeno y simbiosis MA inhiben la expresión de las PIPs como estrategia de conservación de agua en la planta hospedadora, que permite a estas plantas mantener unos altos niveles de contenido hídrico relativo. Estos hallazgos sugieren también que la permeabilidad al agua de las plantas MA y no MA sometidas a estrés hídrico está dirigida por una compleja regulación de las acuaporinas, dependiendo de los papeles específicos que las distintas isoformas jueguen en la planta (Alexandersson et al., 2005; Luu y Maurel, 2005), y que estas variaciones están muy relacionadas con el contenido en ABA de estas plantas (Aroca et al., 2008a). Vías de transporte de agua: apoplástica versus célula a célula Sabemos que el transporte radial de agua hacia los vasos xilemáticos de las plantas se produce mediante dos vías fundamentales, la vía célula a célula y la apoplástica (Steudle, 2000). La contribución relativa de cada vía puede variar notablemente dependiendo de las condiciones ambientales (Steudle, 2000; Martínez-Ballesta et al., 2003) y se asume que la vía célula a célula adquiere mayor relevancia en condiciones de transpiración reducida. Basándonos en este concepto consideramos que en condiciones de sequía, cuando la transpiración se ve reducida, el mejor estatus hídrico encontrado en las plantas MA frente a las no MA podría deberse a un efecto directo de la simbiosis sobre el transporte de agua por la vía apoplástica, ya que estudios previos llevados a cabo en ectomicorrizas apuntaban a que esta vía se veía facilitada por la simbiosis micorrícica (Muhsin y Zwiazek, 2002; Smith et al., 2010). Los datos obtenidos en esta tesis doctoral revelaron que, en efecto, las raíces de plantas MA aumentaron significativamente el flujo de agua por la vía apoplástica en comparación con las plantas no MA, tanto en condiciones óptimas de riego como en condiciones de sequía. Un aumento del transporte de agua por la vía apoplástica compensaría la disminución de Lo y permitiría mantener una L elevada. También encontramos que la presencia de hongos MA en las raíces de la planta hospedadora puede modular la conmutación entre las vías de transporte de agua apoplástica y célula a célula, lo que permite a la planta responder mejor a las demandas de agua de la parte aérea, especialmente en condiciones de déficit hídrico (Bárzana et al., 2012). Relaciones hídricas y acuaporinas Es bien sabido que las acuaporinas juegan un papel fundamental en la regulación del transporte de agua por la vía célula a célula, que como hemos dicho, es la vía fundamental en condiciones de déficit hídrico. Las acuaporinas disminuyen la resistencia al paso del agua a través de las membranas, y puesto que su actividad puede ser regulada, esto proporciona a la planta un mecanismo muy fino de control del transporte de agua a través de sus tejidos. Los resultados del análisis de expresión de todas y cada una de las 31 acuaporinas de maíz revelaron que la expresión de muchas de ellas no está afectada por la simbiosis MA bajo ninguna de las condiciones de regadío aplicadas en ambos experimentos. Sin embargo, la expresión de 16 genes de acuaporinas fue regulada por las MA, aunque de manera diferente dependiendo del tratamiento de estrés hídrico aplicado. Estas 16 isoformas fueron clasificadas en seis grupos en función de los patrones de expresión de sus genes (Ver tabla resumen). En este estudio encontramos que, bajo condiciones de estrés de corta duración, la simbiosis MA aumentó la expresión de los genes de acuaporinas de los patrones 2, 3, 4 y 5, y solo las acuaporinas de los patrones 1 y 6 permanecieron inalteradas. Por el contrario, en condiciones de estrés mantenido, la simbiosis MA disminuyó la expresión de los genes de acuaporinas de los patrones 1, 2 y 4, mantuvo inalterados los genes de los patrones 3 y 5, y solo las acuaporinas correspondientes al patrón 6 aumentaron su expresión. Muchas de estas acuaporinas han mostrado en los análisis de expresión heteróloga su capacidad para transportar diversas moléculas fisiológicamente importantes para la planta además de agua. Esto sugiere que, bajo condiciones de estrés hídrico de corta duración, la simbiosis MA puede aún estimular muchos de los procesos fisiológicos en los que participan las acuaporinas, quizás debido a que estas plantas tienen un mayor acceso a las reservas de agua del suelo inaccesibles para las plantas no MA. Por el contrario, cuando el estrés se vuelve más prolongado, la simbiosis MA restringe muchos de los procesos en los que participan las acuaporinas. En las plantas no MA, la respuesta es una reducción generalizada de la expresión de las acuaporinas y de los procesos en que éstas intervienen. Apoyando esta idea, encontramos que las plantas MA exhibieron una Lo mayor en condiciones de estrés hídrico de corta duración y menor en estrés hídrico sostenido, mientras las plantas no MA redujeron Lo en ambos tipos de estrés hídrico, coincidiendo en ambos casos con las variaciones de expresión de las acuaporinas analizadas. Por otro lado, los niveles de acumulación de acuaporinas mostraron un patrón similar al de expresión génica en condiciones óptimas de riego, donde observamos una fuerte reducción de la expresión y de la presencia de acuaporinas en las raíces de las plantas MA en comparación con las no MA. Por el contrario, al someter las plantas a diferentes condiciones de sequía observamos un patrón diferente de acumulación de acuaporinas en plantas MA y no MA. En este sentido encontramos que, si bien en plantas no MA la sequía produjo una disminución en la acumulación y expresión de las acuaporinas al aumentar la duración del estrés, en las plantas MA se producía un aumento de la acumulación de estas proteínas y una reducción de su expresión génica a medida que se sometieron estas plantas a un estrés hídrico más prolongado e intenso. Los resultados obtenidos a lo largo de esta tesis sugieren que un menor contenido de aquaporinas en las plantas MA cuando crecen en condiciones óptimas de riego puede ser a su vez una ventaja cuando las condiciones ambientales cambian, ya que la planta está intrínsecamente preparada para la conservación de agua, mejorando la eficiencia en el uso de la misma (Sade et al., 2010; Belko et al., 2012a y b). Además, los datos nos muestran que, cuando el estrés se hace más prolongado, las plantas MA están más capacitadas para reaccionar, aumentando su contenido en acuaporinas a medida que el estrés se vuelve más intenso, alcanzando mayores niveles de acumulación que las plantas no MA en condiciones de estrés severo. Las modificaciones post-traduccionales juegan un papel fundamental en el transporte de agua a través de las acuaporinas. En este sentido, los efectos de la micorrización parcial sobre la acumulación de PIPs2 fosforiladas en los compartimentos radicales bien hidratados cuando el otro compartimento radical estaba sometido a sequía, sugieren que las plantas micorrizadas ajustan de manera local, mediante modificaciones post-traduccionales, la actividad de las acuaporinas en función del grado de micorrización e intensidad del estrés. La conductancia estomática y la transpiración suelen aumentar en plantas MA, tanto en condiciones óptimas como de estrés hídrico (Augé, 2001). El hecho de que las plantas sometidas a sequía parcial variasen su conductancia estomática en función de si la sequía afectaba o no al compartimento micorrizado sugiere dos cosas: 1) la sequía afecta menos a las raíces de plantas que están micorrizadas y 2) Las plantas en las que las raíces micorrizadas tienen suficiente acceso a agua no son tan sensibles al estrés como aquellas en las que el aporte de agua depende exclusivamente de las raíces no micorrizadas. El mantenimiento de una elevada conductancia estomática y tasa transpiratoria permite una mayor captación de CO2, necesario para llevar a cabo la fotosíntesis (Allen et al., 1981; Davies et al., 1993; Sheng et al., 2008). Así pues, es esperable que al someter las plantas MA a déficit hídrico, el mantenimiento de la conductancia estomática durante más tiempo al inicio del estrés, favorezca también una mayor actividad fotosintética y con ella un mayor metabolismo y crecimiento de estas plantas frente a las no MA. De hecho, encontramos que las plantas MA continuaron creciendo más que las plantas no MA bajo condiciones de estrés, tanto de corta duración como sostenido. También, fue evidente que una de las mayores ventajas de las plantas micorrizadas frente a las no micorrizadas fue el mantenimiento de la eficiencia fotosintética tanto en condiciones óptimas como durante los periodos de sequía. Las PIPs en hojas podrían estar desempeñando un papel crucial en el control del cierre y apertura estomáticos (Uehlein et al., 2003), así como en la conductancia del mesófilo (Flexas et al., 2006; López et al., 2013), controlando tanto el transporte de agua como de CO2, necesarios para la fotosíntesis (Katsuhara et al., 2008; Flexas et al., 2012). En este sentido, es especialmente interesantes el caso de las PIPs1, ya que se ha sugerido que su contenido en hojas está directamente relacionado con el transporte de CO2 (Otto et al., 2010). A lo largo de esta tesis observamos que existía un mayor contenido en PIPs1 en plantas MA en condiciones óptimas de riego y de sequía parcial no fisiológica, coincidiendo con una elevada transpiración y eficiencia del PSII. Esto apoya la idea de que en condiciones de suficiente acceso a agua, las plantas micorrizadas mantienen un mayor transporte de CO2 necesario para mantener unos elevados niveles fotosintéticos y sugiere que la acumulación de PIPs en las hojas y la eficiencia del sistema fotosintético pueden estar fuertemente relacionadas. Por otro lado, en condiciones de sequía fisiológica, vimos que las plantas micorrizadas sometidas a estrés mantuvieron su eficiencia fotosintética incluso a pesar de una reducida conductancia estomática y bajo potencial hídrico, lo que nos indica que los beneficios de la simbiosis van más allá del simple aporte de agua. Uno de los efectos más claros de la simbiosis MA es el incremento de la adquisición de nutrientes (Barea et al., 2005). Así pues, no hay que descartar que la regulación que la simbiosis MA ejerce sobre las acuaporinas en raíces pueda estar influyendo en la adquisición de estos nutrientes, ya que hemos visto que muchas de ellas pueden transportar compuestos de interés fisiológico para la planta como el NH3, Urea, H2O2, B o Si. En este sentido, las TIPs en las membranas vacuolares y algunas de las NIPs analizadas resultaron especialmente interesantes para el transporte de estos compuestos y parecen tener una fuerte influencia en la respuesta de las plantas al déficit hídrico. Los resultados de esta tesis mostraron cómo las plantas no micorrizadas sometida a estrés hídrico disminuyeron la expresión génica de casi todas las acuaporinas y además, a medida que el estrés fue más severo, disminuyó también el contenido y actividad de PIPs en las membranas celulares de estas plantas. Estos datos en conjunto muestran un mecanismo de prevención de la pérdida de agua y nutrientes celulares respondiendo a una estrategia de conservación de las plantas no MA. Sin embargo, también vimos como la sequía prolongada mantuvo o incluso aumentó la expresión génica de ciertas isoformas específicas como ZmTIP1;1, ZmTIP1;2, ZmNIP1;1 o ZmNIP2;2. Dados los resultados de caracterización funcional, sugeríamos que el aumento de las ZmTIPs1 podría tener una influencia importante en la removilización de compuestos como el N almacenados en la vacuola y necesarios para el correcto funcionamiento de las plantas bajo estas condiciones. El aumento de las TIPs1 también podría favorecer la detoxificación de H2O2, que se transportaría a las vacuolas evitando su exceso en el citosol (Bienert et al., 2007). Por otro lado, el aumento de ZmNIP2;2 podría suponer una ventaja para la acumulación de Si en las raíces de corona, mejorando la resistencia a la caída del tallo en condiciones de sequía severa (Hochholdingeret al., 2004). Por último, todas ellas podrían estar involucradas en el transporte de B, cuya deficiencia en condiciones de estrés severo podría tener graves consecuencias en la supervivencia de las plantas no MA (Power y Woods, 1997). Por otro lado, las plantas MA mostraron el aumento de casi todas las acuaporinas en condiciones de estrés moderado, lo que les permitiría mantener los procesos fisiológicos de la planta el mayor tiempo posible mediante un incremento en la acumulación de agua y los solutos del suelo que pueden ser transportados por ellas. Esta estrategia permitiría a la planta absorber el agua residual y los nutrientes del suelo hasta que el estrés es más severo (Postaire et al., 2008). En este sentido, las PIPs estarían jugando un papel fundamental en la absorción y transporte de agua. Las NIPs aparecen generalmente en la membrana plasmática y las distintas isoformas aparecen asociadas específicamente a órganos concretos (Choi, 2009) por lo que podrían facilitar la distribución de los diversos compuestos aportados por el hongo MA a los tejidos específicos donde fueran requeridos, mientras las TIPs serían fundamentales para el transporte del exceso de estos compuestos al interior de las vacuolas para su almacenamiento. Por el contrario, ante un estrés severo, las plantas micorrizadas redujeron la expresión de la mayor parte de las acuaporinas, mostrando una estrategia de conservación. Aún así, los análisis de inmuno-localización revelaron un incremento de las acuaporinas ZmPIP2;1/ZmPIP2;2 y ZmTIP1;1 en el cortex de las raíces micorrizadas sometidas a sequía, especialmente en las células arbusculadas y adyacentes a las mismas. También observamos una modificación en la localización subcelular de las proteínas analizadas, lo que en conjunto parece indicar que a nivel subcelular sigue existiendo un intercambio muy activo de moléculas en estas zonas de la raíz debidas a la presencia y actividad de los hongos MA. En cualquier caso, los datos obtenidos a lo largo de esta tesis doctoral sugieren que la simbiosis MA ejerce un fino control sobre las acuaporinas de la planta hospedadora y los procesos en los que estas intervienen. Esta modulación se ajusta a las condiciones ambientales y la severidad y duración del estrés, permitiendo una mayor flexibilidad en las respuestas de las plantas MA, lo que se traduce en una ventaja para hacer frente al estrés hídrico impuesto. CONCLUSIONES 1. Las plantas MA mantienen un control más eficiente de la producción y acumulación de osmoreguladores tanto en raíces como en hojas en función del estrés impuesto. Además, los sistemas antioxidantes de las plantas MA actuaron a nivel local, afectando especialmente a las zonas de las raíces sometidas a estrés hídrico. Así, los beneficios de la micorrización incluyen la compartimentación de los daños causados por el estrés, lo que permite a la planta continuar con sus procesos fisiológicos por más tiempo, al limitar el daño localmente. 2. La regulación del contenido en ABA por la simbiosis MA podría estar jugando un papel fundamental en el control de Lo a través de una respuesta dependiente de ABA de las acuaporinas involucradas. La combinación de ABA exógeno y simbiosis MA inhibe la expresión de las PIPs como estrategia de conservación de agua en la planta hospedadora, que permite a estas plantas mantener un elevado estatus hídrico tanto en condiciones óptimas como de sequía. 3. La simbiosis MA aumenta significativamente el flujo relativo de agua por la vía apoplástica, tanto en condiciones óptimas de riego como en condiciones de sequía. La presencia del hongo MA en las raíces de la planta hospedadora flexibiliza la conmutación entre las vías apoplástica y célula a célula, lo que permite a la planta responder mejor a las demandas de agua de la parte aérea, especialmente en condiciones de déficit hídrico. 4. La simbiosis MA regula la expresión y acumulación de un amplio número de acuaporinas de la planta hospedadora, incluyendo miembros de las diferentes subfamilias de acuaporinas, y alterando también la distribución de las mismas a nivel subcelular. Así, hemos observado una acumulación de acuaporinas en las membranas alrededor de las células arbusculadas, lo que indica su posible influencia en el intercambio de compuestos entre ambos simbiontes. 5. Las acuaporinas reguladas por la simbiosis MA pueden transportar agua y una serie de compuestos de importancia fisiológica para la planta. En condiciones de estrés moderado, la simbiosis MA es capaz de mantener elevada la expresión de la mayoría de estos genes y, posiblemente, de los procesos fisiológicos en los que están implicados estas acuaporinas. En condiciones de estrés más severo, las plantas MA inhiben estos procesos. En las plantas no MA, incluso ante un estrés moderado, la respuesta es una inhibición generalizada de las acuaporinas y, posiblemente, de los procesos en que éstas están implicadas. Por lo tanto, la simbiosis MA actúa sobre dichas acuaporinas de manera concertada y dependiendo de la intensidad del estrés, para alterar las relaciones hídricas y la fisiología de la planta, permitiéndole así responder mejor ante las condiciones ambientales adversas. BIBLIOGRAFÍA Alexandersson E.,Fraysse L., Sjövall-Larsen S., Gustavsson S., Fellert M., et al. (2005) Whole gene family expression and drought stress regulation of aquaporins. Plant Molecular Biology 59, 469¿484. 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