Multidisciplinary analysis of the energetics and mechanism of assembly of amyloid oligomeric precursors

Resumen

Este proyecto de tesis se puede dividir en varias etapas sucesivas, que se resumen en los siguientes párrafos. Una primera parte de este trabajo incluye un estudio detallado de los estados iniciales de agregación del dominio Spc-SH3, concretamente empleamos su mutante N47A. Hemos mostrado que las cinéticas de nucleación del dominio Spc-SH3 obedecen a una cinética irreversible de orden superior. El estudio las cinéticas de agregación, empleando multitud de métodos biofísicos, nos ha permitido deducir que los estados iniciales del proceso de nucleación amiloide implica un pre-equilibrio que incluye la oligomerización de intermedios parcialmente plegados seguida de una conversión conformacional de las hebras polipeptídicas entre los oligómeros. Este último proceso conduce a la formación de núcleos amiloides. Un modelo matemático simple puede describir muy bien los resultados experimentales de velocidad inicial de agregación y su dependencia con la concentración de proteína. El modelo nos ha permitido obtener magnitudes termodinámicas para caracterizar el altamente inestable intermediario amiloidogénico y sus oligómeros. También se ha mostrado que las condiciones ambientales, como la concentración de proteína y la concentración de sal, pueden afectar fuertemente en la estabilización y población de los precursores de la agregación, dando lugar a las diferentes condiciones de nucleación que pueden producir dos distintos mecanismos de agregación y asimismo producir las diferentes morfologías de las fibras. La aproximación cinética presentada aquí puede ser aplicable para caracterizar los intermedios amiloidogénicos y los precursores oligoméricos de la agregación amiloide en proteínas relacionadas con enfermedades. Subsecuentemente, empleando este modelo, nos embarcamos al estudio del efecto de las sales en las cinéticas de agregación del mutante N47A del dominio Spc-SH3. En este estudio mostramos que los aniones presentaban un efecto drástico en la velocidad de nucleación, mientras que los cationes no presentaban un papel importante en las condiciones del estudio. Las magnitudes relacionadas con la termodinámica y cinética en el proceso de nucleación obtenidas de las cinéticas de agregación nos permiten identificar que se ven moduladas por los aniones. La energía de un estado intermediario amiloidogénico poco poblado se ve reducida por la actividad de aniones en disolución, aumentando su población, acelerando subsecuentemente el proceso de fibrilación. Este resultado incrementa nuestro conocimiento de los dinámicos estados tempranos implicados en el desencadenamiento de la cascada de agregación amiloide. Este control sobre la velocidad de agregación ejercida por la modulación de la estabilidad de las especies pobladas mediante el uso de sales nos brinda la posibilidad aumentar nuestro conocimiento de la patogénesis de las enfermedades relacionadas con amiloides. Una vez investigados los efectos ambientales en las etapas iniciales de la agregación, pasamos a estudiar los efectos de las mutaciones en la proteína. Para ello empleamos un conjunto de mutaciones a lo largo de todos los elementos estructurales del dominio Spc-SH3 para producir cambios locales en la estabilidad. Sorprendentemente, existe una notable falta de correlación entre la estabilidad termodinámica del estado nativo y la tendencia a formar fibras amiloides para todos los mutantes. En su lugar encontramos que la inhibición y la potenciación de la agregación amiloide ejercida por las mutaciones se produce principalmente a nivel de una modificación en la eficiencia efectiva en la formación de los dinámicos oligómeros iniciales que preceden al proceso de formación de núcleos amiloide. Un análisis robusto de las cinéticas y de la termodinámica, y basándonos en el modelo de nucleación que previamente habíamos desarrollado, nos ha permitido identificar los residuos que juegan un papel importante en la estructura del estado intermediario amiloidogénico y participan en su proceso de auto-asociación intermolecular. Parece que la transición conformacional que da lugar a la nucleación amiloide sigue un mecanismo completamente diferente al que se produce en los procesos de plegamiento-desplegamiento e implica el desplegamiento parcial del núcleo del dominio y que la asociación intermolecular se produce vía el extremo N-terminal de la cadena. Tomados juntos, estos indicios proporcionan un profundo entendimiento sobre las fuerzas fundamentales que controlan la competición entre plegamiento, plegamiento erróneo y agregación. Esta comprensión indudablemente enriquece el conocimiento fundamental para el desarrollo de estrategias racionales para el diseño de compuestos terapéuticos capaces de interferir en los complejos procesos de auto-asociación, de tal forma que se reduzca el riesgo de que se produzca plegamiento erróneo en las proteínas. Finalmente, una vez desarrollada una robusta metodología para analizar las cinéticas y la termodinámica que determina la nucleación de amiloides usando el sistema Spc-SH3 como proteína modelo, el siguiente paso lógico era estudiar un sistema en la que la proteína esté relacionada con el desarrollo de enfermedades. En este trabajo hemos seleccionado la ¿-Sinucleina (aSyn), una proteína relacionada con el mal de Parkinson. Debido a las implicaciones funcionales de la aSyn en interacción con lípidos y surfactantes aniónicos, hemos centrado nuestro estudio en la interacción de la aSyn con SDS, un conocido surfactante empleado como modelo mimético de una membrana. Para darle aún más relevancia biológica a nuestro estudio, dado que la aSyn se encuentra N-acetilada in vivo, hemos comparado las formas N-acetilada y sin modificar de la aSyn. Hemos demostrado que a una concentración sub-CMC de SDS se estabiliza una forma oligomérica y parcialmente plegada de aSyn. Estos oligómeros constituyen especies óptimas para la formación espontánea y eficiente de núcleos amiloides, que conducen a una fribrilación amiloide rápida, libre de tiempo de espera de nucleación. En contraste, a una concentración mayor de SDS, la aSyn interactúa con micelas de SDS, que evitan que se produzca la agregación. Aunque la forma N-acetilada de la aSyn no produce cambios significativos en la forma desplegada en disolución, hemos mostrado evidencias de que la acetilación incrementa la afinidad por las micelas de SDS. Esto produce una disminución de la población de oligómeros y, asimismo, reduce significativamente la tendencia a formar amiloides. Estos resultados establecen una base sólida sobre la que un análisis más extenso de las cinéticas de agregación puede ser llevado a cabo, de forma similar al que hemos realizado con el dominio Spc-SH3. El encuentro de unas condiciones en las que se produce una cinética de agregación en condiciones de nucleación rápida, libres de tiempos de espera de nucleación, nos permite aplicar nuestro modelo de nucleación con el objetivo de extraer magnitudes cinéticas y termodinámicas que caractericen los precursores clave en la amiloidogénesis. El impacto potencial que tiene el desarrollo de esta metodología es enorme. Este es uno de los pocos estudios que proporcionan propiedades termodinámicas relevantes de los precursores de la agregación. Esto permite evaluar cómo y a qué nivel se producen las alteraciones sobre las propiedades del sistema. De la misma forma, además del efecto de las sales iónicas y las mutaciones, muchas otras variables se podrían evaluar, como son el pH, el efecto del disolvente (cosolventes) o la adición de compuestos inhibidores o activadores. Asimismo la complejidad matemática de nuestro modelo de nucleación no es excesiva y permite la obtención rápida de información con un bajo tiempo cómputo. Por otro lado, nuestra metodología presenta algunas limitaciones. Es necesaria una importante cantidad de información previa a nivel de preparación de las muestras para estar en las condiciones de nucleación rápida, sin tiempos de espera de nucleación, en las que nuestro modelo sea aplicable. Esto mismo limita el rango de condiciones experimentables analizables. A pesar de estas limitaciones, nuestra metodología se revela como una potente herramienta para el estudio del mecanismo de agregación de proteínas relacionadas con enfermedades y sus factores de riesgo, en especial para caracterizar sus formas oligoméricas iniciales que, como ya hemos mencionado, son las responsables de los efectos citotóxicos relacionados con esas patologías.