Inducción de apoptosis en células tumorales mediante inhibidores selectivos de dapk1

Resumen

Los derivados análogos de los nucleósidos son compuestos endógenos involucrados en muchos procesos biológicos, destacando las purinas como pequeñas moléculas heterocíclicas que van a inhibir a multitud de cinasas implicadas en rutas de proliferación y muerte celular. En la compleja red formada por estas vías de señalización celular, las proteínas cinasas constituyen la clase más importante de diana terapéutica debido al papel central que ocupan en estas vías. La vasta mayoría de estas dianas están siendo investigadas para el tratamiento del cáncer, pero la función cinasa está también desregulada en otros desordenes inmunológicos, neurológicos, metabólicos e infecciosos, lo que ha generado un considerable interés en desarrollar pequeñas moléculas inhibidoras para el tratamiento de dichos desordenes. Existen gran cantidad de librerías de pequeñas moléculas frente a un alto número de proteínas cinasas implicadas en las rutas de señalización, muchas de ellas utilizadas en clínica. Así, las librerías de purinas con distintos sustituyentes se han convertido en una herramienta atractiva no sólo para el desarrollo de nuevos fármacos antitumorales sino para esclarecer las rutas moleculares implicadas en el cáncer. Este trabajo aborda el estudio de una colección de 18 compuestos derivados de purinas poli-sustituidas sintetizados a partir de una novedosa ruta en un sólo paso partiendo de 4-alquilamino-5-amino-6-cloropirimidinas, alcóxidos primarios y N,N-dimetilformamida o bien N,N-dimetilacetamida, que va a estar controlada por el tamaño de la amida. El análisis del efecto de los compuestos derivados de purinas en líneas tumorales Jurkat y K562 ha revelado una importante actividad antiproliferativa para cuatro de los compuestos de la colección: 5e, 5i, 6a y 6d. Además, fue efectiva de igual modo en otras líneas derivadas de tumores hematopoyéticos y el compuesto 6d mostró un potente efecto inhibidor de la proliferación en las líneas derivadas de cáncer de mama, cérvix y piel. En cualquier caso, el tratamiento con los compuestos derivados de purinas va a reducir drásticamente su efecto inductor de muerte en líneas T primarias derivadas de individuos sanos. Tras el estudio de las poblaciones en fase sub-G1 del ciclo celular y la expresión de anexina-V hemos podido confirmar que la muerte celular en líneas tumorales T Jurkat y eritroblastoides K562 es debida a un proceso específico de inducción de apoptosis y no de necrosis. Además, esta apoptosis va a ser dependiente de caspasas, como reveló la aparición de productos de degradación resultantes de la activación de las caspasas iniciadoras 8 y 9 y la liberación de anión superóxido (02- ) y la despolarización de la membrana mitocondrial interna implican a la vía mitocondrial en la inducción de muerte por apoptosis ejercida por los compuestos en células T Jurkat. El efecto regulado que los compuestos ejercen en células tumorales T que sobreexpresan elevados niveles de las proteínas anti-apoptóticas Bcl-2 y Bcl-x, implica nuevamente a la ruta mitocondrial o intrínseca. Sin embargo, a pesar de que el efecto proapoptótico que muestran los compuestos se ve reducido tras la sobreexpresión de las proteínas Bcl-2 y Bcl-x, los compuestos 6a y 6d mostraron unos niveles de inducción de apoptosis elevados en estos clones a las dosis más altas y dado que se ha visto que una expresión incrementada de Bcl-2 conduce a una mayor resistencia a las drogas quimioterápicas actuales e incluso a la radioterapia, el efecto proapoptótico que presenta los compuestos 6a y 6d en líneas tumorales que sobreexpresan Bcl-2 los convierten en una prometedora terapia para este tipo de cánceres. Para caracterizar la diana sobre la que estaban actuando los compuestos realizamos un ensayo enzimático in vitro sobre un panel de 96 cinasas implicadas en las principales rutas de proliferación y muerte, desvelando la acción inhibidora de los compuestos sobre una única proteína, la proteína asociada a muerte DAPK1. La proteina cinasa asociada a muerte o DAPK1 (Death-associated protein kinase 1) es una Ser/Thr cinasa regulada por Ca2+/CaM que media muerte celular y actúa como un importante supresor tumoral dada su capacidad para sensibilizar a las células frente a señales apoptóticas. Presenta un complejo mecanismo de regulación que tiene como evento principal la autofosforilación de la Ser308 situada en su dominio regulador y que va a mantener silenciada la actividad pro-apoptótica de forma basal. Tras estudiar el estado de fosforilación/defosforilación de DAPK1 en células Jurkat tratadas con los compuestos, mostramos que éstos están inhibiendo la actividad catalítica de su dominio cinasa y por tanto está bloqueando el mecanismo de autoinhibición por fosforilación de la ser308 del dominio regulador de DAPK1, lo que está generando una enzima defosforilada y constitutivamente activa, que va a incrementar su participación en la inducción muerte por apoptosis en células tumorales Jurkat. El tratamiento combinado de drogas desmetilantes y nuestros compuestos análogos de purinas en la línea tumoral Raji derivada de leucemia linfoblástica crónica, que presenta una expresión ausente de DAPK1 por metilación de su promotor, produjo un efecto inductor de muerte celular de forma transitoria como resultado de la desmetilación del promotor, reafirmando la idea de una posible terapia combinada y reafirmando la actuación específica de nuestros compuestos sobre la proteína DAPK1. En resumen, nuestros resultados muestran la capacidad de los cuatro compuestos derivados de purinas 5e, 5i, 6a y 6d de inhibir la proliferación e inducir la muerte celular por apoptosis en células Jurkat y K562 a través de la inhibición específica del proceso de autofosforilación de la serina 308 del dominio catalítico de la proteína DAPK1, lo que genera una proteína constitutivamente activa que va a potenciar su participación en el proceso de muerte por apoptosis de células tumorales. Así, estaríamos presentado los primeros inhibidores específicos de la actividad enzimática de la proteína inductora de muerte DAPK1, lo que representaría un avance sustancial para abordar en el futuro no sólo nuevas estrategias de terapia antitumoral, sino el estudio de la propia proteína y de todos los procesos en los que participa, que pueden ayudar a comprender mejor el complejo proceso tumoral.