Producción y caracterización de biosurfactantes obtenidos por linajes de bacillus sp. Aisladas de estaciones del tratamiento de depuración de aguas residuales y del suelo de manglar (Brasil)

Resumen

RESUMEN Los biosurfactantes son sustancias de origen microbiano que poseen actividad superficial. Un grupo de biosurfactantes especialmente eficaces son los lipopéptidos, entre los que destaca la surfactina, que son producidos por bacterias del género Bacillus mediante la transformación de sustratos renovables. Dichos tensioactivos presentan un gran número de ventajas cuando se los compara con los tensioactivos sintéticos tradicionales. En el presente estudio se investigó la producción de biosurfactantes, y en particular la de surfactina, mediante procesos fermentativos con diferentes cepas de Bacillus. Para ello se utilizaron medios de cultivo de diferente procedencia (naturales y sintéticos), habiéndose dado especial atención al empleo de fuentes de carbono residuales, como son los residuos del procesado del anacardo, y en concreto de la producción de zumo del fruto del anacardo clarificado (¿cajuína¿). El uso de fuentes de carbono no convencionales se justifica debido a la necesidad de reducir los costos de producción de los biosurfactantes, ya que en la actualidad la producción a gran escala de biosurfactantes resulta todavía poco atractiva económicamente. Por otra parte, el uso de subproductos de la industria del anacardo resulta una alternativa muy interesante, ya que en Brasil, y concretamente en el estado de Ceará, se generan elevados volúmenes de estos subproductos. Además los biosurfactantes producidos fueron posteriormente estudiados desde el punto de vista estructural y de sus propiedades interfaciales. Tal y como se ha indicado, en las fermentaciones se emplearon diferentes cepas de Bacillus (todas ellas aisladas en Brasil), de las cuales se destaca la cepa denominada ICA56, aislada de suelo de manglar (Manglar de Icapuí, Brasil). Desde este punto de vista el trabajo se desarrolló en dos etapas: 1. Etapa1. Se estudió la producción y caracterización de biosurfactantes mediante diferentes cepas (B. subtilis LAMI005, Jag 248, Jag 249, ICA 24, ICA 56) y medios de cultivo. 2. Etapa 2. En ella se desarrollaron estudios exhaustivos con la cepa denominada ICA56, en los que el biosurfactante producido ha sido caracterizado en cuanto a sus propiedades interfaciales (tensión superficial, tensión interfacial, concentración micelar crítica o CMC, y ángulo de contacto), capacidad emulsionante y estructura química. Asimismo, también se estudió la compatibilidad ambiental del producto mediante ensayos de biodegradabilidad y toxicidad. Finalmente se desarrollaron ensayos de remediación de suelos contaminados con aceite lubricante con la finalidad de evaluar el potencial de uso del biosurfactante en la recuperación de suelos contaminados con hidrocarburos. Cómo principales resultados de la Etapa 1, se destaca que, en las condiciones experimentales adoptadas, el microorganismo Bacillus subtilis LAMI005 fue capaz de producir biosurfactante, llegando a alcanzar valores de concentración de 225 mg/L (pH 6.0) y 275 mg /L (pH 7.0) en el medio de cultivo (Anexo A). Bajo todas las condiciones estudiadas, la producción de biosurfactante vino acompañada de una reducción de la tensión superficial del medio líquido hasta valores de 28,3± 0,3 mN/m. Además, el microorganismo demostró poseer capacidad para emulsionar diversos hidrocarburos (aceite de soja, queroseno y n-hexadecano) con un valor de índice de emulsificación (IE24) superior al 60%. Los análisis estructurales realizados, en concreto los espectros vibracionales obtenidos en la región del infrarrojo (FTIR), confirman que el biosurfactante producido pertenece a la clase de los lipopéptidos. Por otra parte, también se verificó que el microorganismo denominado Bacillus sp. Jag248 presenta una clara producción de surfactina, alcanzando valores de concentración de hasta 161.41 ± 0.01 mg/L en medio mineral; dicha producción fue acompañada de una reducción de la tensión superficial hasta los 28.50 mN/m. El biosurfactante producido fue capaz de emulsionar aceite de soja, n-hexadecano y queroseno, presentando valores de IE24 de 50%. En lo que se refiere al Bacillus sp. Jag249, se ha verificado que, en las condiciones experimentales adoptadas, no fue capaz de producir biosurfactantes. En cuanto a las cepas ICA24 e ICA56, se llegó a la conclusión de que las mismas son capaces de producir biosurfactantes, y por lo tanto, reducir significativamente la tensión superficial de los medios de cultivo (valores finales de aproximadamente 28.25 ± 0.4 mN/m). Entre las cepas estudiadas, la que permitió alcanzar una mayor concentración de biosurfactante en un medio mineral adicionado de solución de micronutrientes e inóculo LB Broth fue la ICA56 (329.14 ± 0.00 mg/L) seguida de la cepa ICA24 (111.87 ± 0.00 mg/L, medio adicionado con jugo de anacardo clarificado). Las propiedades interfaciales determinadas en la etapa 2, tensión superficial (28.20 ± 0.07 mN/m), tensión interfacial (5.26 ± 0.08 mN/m a 65 ºC, para una concentración de 60 mg/L), y CMC, están de acuerdo con la literatura. Adicionalmente, se verificó que los valores de tensión superficial y tensión interfacial disminuyen con el aumento de temperatura (intervalo 25 ¿ 65°C). Mediante análisis de Espectroscopía Infrarroja (FTIR) y Espectrometría de Masas (MS) se identificó al biosurfactante producido por ICA56 como surfactina. Se investigó también la producción simultánea de biosurfactantes y enzimas por el microorganismo ICA56, constatándose la presencia de amilasas y proteasas en el medio de fermentación al final del proceso. En lo que se refiere a los ensayos de toxicidad, el biosurfactante presentó una baja toxicidad para diferentes organismos, cómo son las microalgas (Selenastrum capricornutum), microcrustáceos (Daphnia magna) y la bacteria Vibrio fischeri, presentando valores de EC50 de 65.03 mg/L, 170.09 mg/Ly 912.35 mg/L, respectivamente. El biosurfactante producido por ICA56 presentó también una alta biodegradabilidad, siendo degradado tanto por bacterias presentes en aguas residuales urbanas (población mixta y aireada) cómo por Pseudomonas putida. Por último los ensayos de lavado de suelos contaminados con aceites lubricantes permitieron estudiar el efecto de la temperatura y de la concentración del biosurfactante producido por ICA56 sobre la eficacia de lavado. Mediante técnicas estadísticas, se comprobó la significancia de ambos parámetros. Los mejores resultados de lavado (85% de eficacia) se obtuvieron a 65 ºC, para una concentración de biosurfactante de 60 mg/L. En ensayos cualitativos también se verificó que el microorganismo ICA56 es capaz de degradar de forma eficiente petróleo y mezclas de aceite de girasol e oliva (tanto virgen como usado), lo que sugiere la posibilidad de su uso para fines de biorremediación. Palabras clave: Bacillus sp.; producción de biosurfactantes; surfactina, remediación de suelos, biodegradabilidad; toxicidad