Bases moleculares que gobiernan la movilidad swarming de sinorhizobium meliloticonexión con formación de biopelículas y establecimiento de simbiosis

Resumen

Los rizobios son bacterias del suelo capaces de establecer simbiosis mutualista fijadoras de nitrógeno con plantas leguminosas. Existe un gran conocimiento sobre los genes bacterianos responsables de los rasgos más característicos de esta interacción: nodulación y fijación de N. Sin embargo, el conocimiento existente sobre las primeras etapas de la interacción como la adsorción y colonización de la superficie de la raíz, en los que la movilidad bacteriana y la capacidad de formar biopelículas pueden desempeñar un papel importante, es escaso. Se sabe que los procesos de quimiotaxis y movilidad, aunque no son esenciales para la nodulación o la fijación de nitrógeno, pueden facilitar el establecimiento de la simbiosis al dirigir a los rizobios hacia los sitios más adecuados para la infección de la planta hospedadora, influyendo así en la eficiencia y capacidad competitiva por la formación de nódulos. Pese a ello, son pocas las investigaciones que se han centrado en identificar señales medioambientales y reguladores que controlan la capacidad de movimiento de los rizobios, identificar y caracterizar distintos modos de translocación en superficie de estas bacterias así como determinar el papel que pueden tener cada uno de ellos en las diferentes etapas de la interacción con la planta. Sinorhizobium meliloti, el endosimbionte de alfalfa, constituye un modelo dentro de la clase de las alfa proteobacterias para el estudio de distintos aspectos de la movilidad bacteriana que difieren notablemente del paradigma de enterobacterias. Fue precisamente en esta bacteria, durante las investigaciones llevadas a cabo por el grupo en el que se ha desarrollado este trabajo, donde por primera vez se identificó la movilidad swarming asociada a un rizobio (Soto et al. 2002). El swarming es un tipo de translocación bacteriana en superficie, dependiente de acción flagelar y caracterizado por ser un movimiento rápido y coordinado que conlleva un proceso de diferenciación celular. En bacterias patógenas de animales, este tipo de translocación que muestra gran conexión con la capacidad de formar biopelículas, favorece la virulencia. En S. meliloti, el swarming se identificó por primera vez asociado a un mutante en el gen fadD que codifica una acil-CoA ligasa específica de ácidos grasos de cadena larga. Esta mutación, además de alterar la expresión de genes simbióticos y de movilidad, provoca defectos en la capacidad de nodular plantas de alfalfa (Soto et al. 2002). Este hecho unido a resultados obtenidos en otros rizobios, sugiere que componentes esenciales para el swarming y/o factores que se co-regulan con este proceso, pueden ser importantes en la interacción con la planta. Investigaciones enfocadas a la caracterización del swarming en S. meliloti han revelado entre otros resultados que i) el control del desplazamiento en superficie puede ser distinto entre distintas cepas de S. meliloti, ii) la importancia del sideróforo rizobactina 1021 (Rhb1021) en la translocación en superficie de la cepa Rm1021 (Nogales et al., 2010; Nogales et al., 2012), o iii) la conexión existente entre movilidad swarming, formación de biopelículas y capacidad colonizadora de raíces de alfalfa (C.V. Amaya-Gómez 2013). Con estos antecedentes, el objetivo de este trabajo ha sido profundizar en las bases moleculares, determinantes genéticos y señales, que gobiernan la movilidad en superficie de la bacteria modelo S. meliloti, investigando además su posible conexión con formación de biopelículas y establecimiento de simbiosis con alfalfa. Con el fin de identificar determinantes genéticos que pudieran estar implicados en la movilidad en superficie de S. meliloti, al inicio de este trabajo se llevó a cabo una aproximación genética basada en la caracterización de transposantes derivados de mutantes fadD de S. meliloti (1021fadD y GR4fadD) que estuvieran alterados en desplazamiento en superficie. Se han caracterizado un total de 14 transposantes (7 derivados de 1021fadD y 7 derivados de GR4fadD). Llamó la atención desde un principio que ninguno de los transposantes derivados de 1021fadD mostrasen una motilidad nula en superficie, mientras que en el caso de GR4fadD, hasta 5 transposantes presentaron este fenotipo. Este hecho apuntaba a la existencia de distintos mecanismos implicados en el movimiento en superficie de estas bacterias, hipótesis que ha sido corroborada en estudios posteriores. La caracterización genética de los distintos transposantes ha puesto de manifiesto la participación de genes relacionados con movilidad tales como genes esenciales en la síntesis, ensamblaje y funcionamiento del flagelo (visN, visR, flhA, flgG, flgI, flgH, motC), y genes de quimiotaxis (cheA). Pero también se han identificado genes que aparentemente no están relacionados con movilidad bacteriana como genes de respuesta a estreses ambientales (sodB), reguladores que afectan la producción de exopolisacáridos (exoX y emmA), además de un gen de función hasta ahora desconocida (smc00525). De los 14 genes identificados, sólo dos (exoX y smc00525) afectan específicamente la translocación en superficie de mutantes fadD de S. meliloti, lo que motivó un estudio más detallado abordado en el capítulo 2. Aunque todos los transposantes aislados en este estudio dieron lugar a la formación de nódulos fijadores de nitrógeno, algunos presentaron distinta capacidad infectiva y competitiva. Así, NS26(1021FDCSSflgG::Tn5), SPS324 (1021FDCSScheA::Tn5), GNS5(1021FDCSSflgK::Tn5), y GSPS51(GR4FDCSSsmc00525::Tn5), mostraron menor capacidad infectiva que la cepa parental, mientras que los transposantes NS33(1021FDCSSsodB::Tn5), GNS43(GR4FDCSSflgC::Tn5), GNS76(GR4FDCSSvisN::Tn5) y GNS61(GR4FDCSSemmA::Tn5), resultaron estar afectados en competitividad. La caracterización genética y fenotípica de los transposantes derivados de fondos fadD de S. meliloti alterados en movilidad en superficie, centró nuestra atención en tres genes: cheA, exoX y smc00525. Las razones de nuestro interés se basaban en que por un lado, el gen cheA se había identificado asociado a un transposante que mostraba mayor translocación en superficie que la cepa silvestre, efecto contrario al que se había descrito en la bibliografía que genera la pérdida de función de la autoquinasa de quimiotaxis en enterobacterias. Además el transposante afectado en cheA mostraba un defecto en infectividad. Por otro lado, los genes exoX y smc00525 fueron los únicos genes identificados que afectaban específicamente la translocación en superficie de mutantes fadD de S. meliloti, sin tener efecto en movilidad swimming. Para asegurar que los fenotipos observados eran debidos exclusivamente a la alteración del gen que había sido interrumpido por el Tn5, y no el resultado de efectos polares o mutaciones secundarias, como primer paso a un estudio más detallado de los genes de interés, se procedió a la obtención de mutantes por deleción en fase, tanto en el fondo genético de donde procedía el transposante (para corroborar fenotipo) como en otras 3 cepas de S. meliloti (las cepas silvestres GR4 y Rm1021 y otro fondo fadD distinto). Se ha realizado la caracterización fenotípica de un total de 12 mutantes intentando descifrar el papel de cada gen en movilidad en superficie, así como en formación de biopelículas y establecimiento de simbiosis con alfalfa. Se ha comprobado que la histidín quinasa CheA del sistema de quimiotaxis afecta la movilidad swimming de S. meliloti, pero a diferencia de enterobacterias, no es esencial en el movimiento en superficie, ni provoca ningún cambio significativo en este tipo de translocación por lo que se abandonó la idea de continuar con su caracterización. En S. meliloti, ExoX afecta negativamente a la cantidad de succinoglucano (EPS I) producido mediante un mecanismo post-traduccional en el que la estequiometría con ExoY, una glicosiltransferasa requerida en la síntesis del polisacárido, es importante. Se ha descrito que mutaciones en este gen causan un incremento en la producción de EPS I (mayoritariamente la fracción de bajo peso molecular) mientras la presencia de exoX en multicopia reduce significativamente los niveles de succinoglucano. En este trabajo demostramos que independientemente del fondo genético de S. meliloti, la pérdida de función de exoX incrementa la cantidad de succinoglucano producido y la capacidad de formar biopelículas sobre superficies abióticas, estando ambos fenotipos relacionados. Por el contrario el efecto de exoX en translocación en superficie es distinto dependiendo de la cepa de S. meliloti: mientras en GR4 exoX no influye en motilidad, la superproducción de EPS I causada por la deleción del gen exoX en Rm1021 incrementa la translocación en superficie promoviendo tanto movilidad independiente como dependiente de flagelos (Nogales et al., 2012). La producción de niveles normales de EPS I sin embargo, no es esencial en el desplazamiento en superficie de Rm1021, como así lo demuestra el comportamiento de mutantes exoY defectivos en la síntesis del polisacárido. Por último, la caracterización de 4 mutantes delecionados en el gen smc00525 que potencialmente codifica una proteína transmembrana de gran tamaño y muy conservada entre los rizobios, ha revelado que este gen participa en el control de la movilidad en superficie, la capacidad de formar biopelículas así como en la interacción planta-bacteria, en GR4 pero no en Rm1021, cepa en la que sólo se han visto ligeros efectos en movilidad en superficie. SMc00525 promueve la movilidad swarming de GR4 pero interfiere negativamente con el movimiento independiente de flagelos mostrado por GR4fadD. En ausencia de cuerpo basal y gancho (Hook Basal Body, HBB), smc00525 contribuye al desplazamiento en superficie muy especialmente en un fondo fadD. El análisis de expresión génica global de un mutante GR4fadD¿525 en medio mínimo semisólido no aporta gran información sobre el modo de actuación de esta proteína, aunque es llamativa la menor expresión de genes relacionados con la adquisición y metabolismo del hierro. Interesantemente, SMc00525 contribuye a las características simbióticas de S. meliloti GR4 y GR4fadD afectando a los niveles de expresión de genes nod comunes y a la capacidad competitiva de la bacteria. Como último objetivo de esta Tesis, se ha caracterizado la movilidad mostrada por las cepas GR4 y Rm1021 de S. meliloti en dos nuevas condiciones inductoras de movilidad en superficie: agar noble (AN) y 2-tridecanona (2-TDC). El empleo de AN fue resultado de la búsqueda de condiciones que permitieran poner de manifiesto movilidad en superficie en la cepa GR4 de S. meliloti, y que al mismo tiempo permitieran mayor reproducibilidad en los ensayos de translocación en superficie. Tras probar distintos agentes gelificantes a distintas concentraciones pudimos comprobar que la utilización de AN en concentraciones de 0.6-0.8% proporciona condiciones más permisivas y reproducibles para la observación y análisis detallado de movilidad en superficie en S. meliloti que otros tipos de agar como el purificado de la casa comercial Pronadisa, previamente utilizado en estos estudios. Hemos comprobado además que estas mismas condiciones pueden ser utilizadas para estudiar el comportamiento en superficie de otros rizobios como R. etli, R. leguminosarum o S. fredii. Bajo las nuevas condiciones de ensayo, hemos confirmado el papel del hierro en el control de la movilidad en superficie de S. meliloti. Condiciones de deficiencia de hierro reducen el desplazamiento en superficie mostrado por distintas cepas de S. meliloti, pero muy especialmente en el caso de 1021fadD, mientras que la presencia de altas concentraciones de hierro reducen en mayor o menor intensidad el desplazamiento en superficie de cepas silvestres, pero no en mutantes fadD. El empleo de AN nos ha permitido llevar a cabo una caracterización en profundidad del tipo de movilidad en superficie mostrado por GR4 y Rm1021, así como por sus correspondientes mutantes fadD, revelándose notables diferencias en los mecanismos empleados. Así, la cepa GR4 se desplaza en superficie de MM semisólido utilizando swarming ya que es un movimiento absolutamente dependiente de acción flagelar. No obstante, el empleo de dos mutantes aflagelados afectados en distintas fases del ensamblaje del flagelo (flaAB y flgK), ha permitido poner de manifiesto que en ausencia de un HBB completo, GR4 es capaz de poner en marcha un desplazamiento sobre superficie independiente de acción flagelar cuyas bases moleculares no han sido investigadas en este estudio, pero en la que smc00525 parece participar, como ya se ha comentado. A diferencia de GR4, la cepa Rm1021 que muestra mayor capacidad de dispersión en superficie, se desplaza utilizando mayoritariamente un movimiento independiente de flagelos en el que la producción del sideróforo Rhb1021 desempeña un papel importante y que se ve abolido en ausencia de gancho flagelar. Los resultados obtenidos en este estudio también demuestran que el efecto que la mutación fadD ejerce sobre la movilidad en superficie de S. meliloti es altamente dependiente del fondo genético. La ausencia de FadD en GR4 incrementa el desplazamiento en superficie de esta bacteria pero no por un incremento de swarming sino por promover un movimiento independiente de flagelos cuya manifestación requiere la presencia de un HBB completo. A diferencia de lo observado para GR4, una mutación fadD no incrementa significativamente la movilidad en superficie de Rm1021 al interferir drásticamente con el movimiento mayoritario independiente de flagelos característico de Rm1021. Esta interferencia causada por la mutación fadD requiere la presencia de un HBB ensamblado. Durante la búsqueda del metabolito de naturaleza lipídica responsable de los fenotipos asociados a los mutantes fadD de S. meliloti, se identificó la 2-TDC como una metilcetona que se acumulaba sólo en mutantes fadD, y que añadida de modo exógeno como compuesto volátil, inducía la movilidad de la cepa GR4. Utilizando las nuevas condiciones de ensayo, hemos demostrado que la metil undecil cetona promueve la movilidad en superficie de las cepas GR4 y Rm1021 de S. meliloti estimulando tanto el movimiento dependiente como el independiente de flagelos. Este efecto estimulador de la translocación en superficie apenas es apreciable en fondos fadD, pero sí en un mutante defectivo en la síntesis del sideróforo Rhb1021. El análisis transcriptómico de Rm1021 en respuesta a 2-TDC no ha permitido descifrar aún el mecanismo molecular por el que esta metilcetona promueve movilidad en superficie en S. meliloti. No obstante, se ha comprobado que el efecto causado por la 2-TDC en expresión génica de Rm1021 es distinto dependiendo de si las células crecen en medio líquido o sobre una superficie. Sólo en células crecidas sobre superficie semisólida, la aplicación de 2-TDC ha provocado alteraciones significativas en la expresión génica. Además de la ausencia de genes flagelares y de movilidad entre los genes diferencialmente expresados, y la inducción de genes relacionados con respuesta a distintos estreses, destaca la represión de genes previamente relacionados con la translocación en superficie de Rm1021 y que incluye los implicados en regulación, síntesis y transporte del sideróforo Rhb1021. Como conclusión general, este trabajo ha puesto de manifiesto la enorme complejidad del movimiento en superficie de una bacteria que interacciona con plantas como es S. meliloti, y en la que se incluyen las grandes diferencias en los mecanismos de regulación mostradas por cepas de la misma especie. Se ha podido asignar una función a genes no caracterizados hasta el momento como smc00525, así como funciones adicionales a genes previamente descritos pero no relacionados con movilidad (exoX). Los resultados obtenidos han abierto nuevas líneas de investigación como el control coordinado de expresión génica con el estado de ensamblaje del flagelo totalmente desconocido en rizobios, la participación de un nuevo gen en el control de la expresión de los genes nod, o el mecanismo de acción de 2-TDC como molécula señalizadora entre bacterias. La identificación de smc00525 como gen que afecta las propiedades simbióticas de S. meliloti, y de la 2-TDC como compuesto que altera el comportamiento en superficie de las bacterias y limita la infección bacteriana, corrobora la validez de la estrategia basada en la caracterización de las bases moleculares que gobiernan la movilidad en superficie de S. meliloti, para identificar genes y señales con funciones importantes en las interacciones planta-bacteria.