Food allergy and intestinal inflammatory conditions. Study in animal models

Resumen

INTRODUCCIÓN 1. Antedecentes La mucosa intestinal es uno de los principales órganos de defensa del organismo debido a su constante contacto con el exterior a través de los alimentos y de los alérgenos, microorganismos y carcinógenos que los acompañan. Dicha función defensora se lleva a cabo de una forma inespecífica con su especial estructura anatómica (capa mucosa, células epiteliales, lámina propia y capa submucosa) y, de una forma específica, con la ayuda de múltiples componentes externos e internos especializados, donde la microbiota y el sistema inmune juegan un papel clave. La homeostasis intestinal se alcanza no solo a través de la regulación de la función de barrera de la mucosa intestinal, sino también reduciendo la respuesta inmune frente a bacterias y antígenos presentes en los alimentos sobre todo gracias a células como las células epiteliales intestinales. Uno de los principales dilemas del sistema inmune es la identificación de las sustancias extrañas al organismo, reconociendo claramente los componentes propios y diferenciando las sustancias peligrosas de aquéllas que no lo son. En condiciones normales, esta tarea se realiza eficazmente en el proceso denominado tolerancia con una participación importante del aparato digestivo (tolerancia oral) donde la vía oral es la principal ruta de entrada de sustancias ajenas y potencialmente peligrosas como alérgenos y carcinógenos. Se puede definir la tolerancia oral como el estado de inhibición activa de la respuesta inmune frente a un antígeno, por medio de la exposición previa a ese antígeno por vía oral, que confiere una tolerancia al antígeno tanto local como sistémica. Durante los primeros años de vida el sistema inmune va entrando en contacto con antígenos ajenos y por tanto, se va desarrollando la tolerancia oral a ellos. Un sistema inmune inmaduro puede llevar a que se altere la tolerancia oral u homeostasis intestinal de forma que no se diferencie de forma adecuada lo propio de lo ajeno. Esto conducirá a la aparición de enfermedades inflamatorias como por ejemplo la IBD o alérgicas como la alergia alimentaria, la celiaquía o el asma. Cuando se rompe la tolerancia u homeostasis intestinal se produce la inflamación. La inflamación es una respuesta fisiológica de defensa frente a agentes extraños y se puede clasificar en aguda y crónica. En la inflamación aguda se produce una activación de células del sistema inmune como macrófagos, mastocitos y células dendríticas (DC), las cuales son activadas por los antígenos liberando mediadores proinflamatorios como TNF¿, IL-8, IL-6, IL-1, Prostaglandina E2 (PGE2) y Óxido nítrico (NO). Cuando este sistema (inmunidad innata) no es capaz de eliminar el agente patógeno, se pone en marcha la respuesta de células especializadas como los linfocitos B productores de anticuerpos, linfocitos T colaboradores (helper) CD4+ y linfocitos T citotóxicos CD8+. En función de cómo se activen las células T CD4+ generarán distintos tipos de respuesta y secreción de citocinas. Así los linfocitos T activados por el antígeno y otras señales co-estimuladores como la presencia de IL-12 generarán linfocitos Th1 que secretaran IFN¿, la co-estimulación con IL-4 (producida por células NK, mastocitos, basófilos y linfocitos CD4+maduros) generará un tipo de linfocito Th2 secretor de IL-4, IL-10 e IL-13 y, por último, la presencia de IL-23 (producida por macrófagos y células dendríticas) favorecerá un fenotipo Th17 que secretará IL-17 principalmente. Cuando no sea posible finalizar la inflamación aguda o bien se vayan produciendo procesos inflamatorios recurrentes aparecerá la inflamación crónica. En ella se detecta una infiltración continua en el foco dañado de células como macrófagos, linfocitos y células plasmáticas que conducen a la formación de tejido fibroso característico de la cronicidad del proceso. Esta inflamación crónica conduce a distintas patologías como por ejemplo la IBD. La IBD, engloba la colitis ulcerosa (Ulcerative colitis, UC) y la enfermedad de Crohn (Crohn¿s Disease, CD), caracterizadas por su comportamiento cíclico con periodos de remisión y periodos de agudización y con diarrea, dolor abdominal, pérdida de peso, hemorragia intestinal, fiebre, fatiga y malestar general como signos más importantes. A veces aparecen síntomas extra-intestinales como artralgias. Aunque existen similitudes entre ambas enfermedades, las diferencias son notables en cuanto a la distribución de la inflamación, la afectación de la mucosa intestinal y la consistencia de las heces. Al igual que las alergias, son enfermedades relacionadas directamente con el estilo de vida occidental, con una incidencia creciente en todos los países industrializados. Aunque la causa de la enfermedad inflamatoria intestinal no se conoce, se supone una ruptura de la tolerancia oral como consecuencia de factores genéticos y medioambientales. En los pacientes con la enfermedad activa o en fase de remisión, se produce un incremento de la permeabilidad intestinal que permite la llegada de sustancias hasta el sistema inmune de la lámina propia, desencadenando la respuesta inflamatoria. Hasta hace poco se pensaba que la enfermedad de Crohn se caracterizaba por una reacción de tipo Th1 asociada a un exceso de IFN¿, TNF¿ e IL-12, mientras que la colitis ulcerosa era una respuesta Th1/Th2 atípica con una producción de TNF¿, IL1ß e IL-6. Pero en la actualidad se dibuja un escenario más complejo con la participación de linfocitos Th17 e IL-17 en ambas patologías. El tratamiento de estas patologías es sintomático y se basa en la disminución de la inflamación y los síntomas con la utilización de glucocorticoides, aminosalicilatos, inmunosupresores, anticuerpos monoclonales, antibióticos y probióticos. Por otro lado, la alergia es una respuesta inflamatoria de tipo Th2 en la que individuos susceptibles responden a antígenos inocuos. Brevemente, la alergia se inicia con la participación de linfocitos Th2 que producen IL4 e IL-13, responsables del cambio en los linfocitos B para la producción de Inmunoglobulina E (IgE). Ésta activa a mastocitos y basófilos liberadores, entre otras sustancias, de aminas biógenas (histamina, serotonina) responsables de los síntomas de la alergia. También se liberan mediadores como TNF¿, IL-3, IL-5 y GM-CSF responsables de las fases temprana y tardía de la alergia y de la activación de linfocitos Th2. La participación de los eosinófilos es activada por los linfocitos Th2 y resulta crucial para el desarrollo de las reacciones alérgicas como el asma alérgica, gastroenteropatías eosinofílicas e incluso en las alergias IgE independientes. La participación de los linfocitos T reguladores (Treg) en la alergia es importante ya que pueden disminuir la producción de IgE por parte de las células plasmáticas, pero no son capaces de anular una respuesta alérgica ya establecida. Una alergia alimentaria se puede definir como ¿un efecto adverso para la salud derivado de una respuesta inmune específica que ocurre de forma repetida tras la exposición a un determinado alimento¿. El creciente número de alergias en los países desarrollados se puede explicar por la ¿hipótesis de la higiene¿ que justifica los fallos en la respuesta inmunológica en base a un déficit en el contacto con sustancias extrañas durante los primeros años de la vida. En la actualidad se sospecha que cualquier tipo de respuesta inmune (Th1 y/o Th2) durante la infancia ayuda a la maduración del sistema inmune y el desarrollo de la tolerancia. El incremento de la permeabilidad intestinal es una constante en los pacientes que sufren de alergia alimentaria, pero no se puede afirmar con certeza si se trata de la causa o la consecuencia de la misma. Además de los síntomas intestinales como diarrea y dolor abdominal, la alergia alimentaria puede afectar a otros órganos como la cavidad oral, la piel o el tracto respiratorio. Aunque la alergia alimentaria se caracteriza por la presencia de anticuerpos IgE, también existe una alergia independiente de esta inmunoglobulina, con una respuesta intestinal retardada debido a la producción de TNF¿. Los alimentos que más frecuentemente provocan alergia son la leche de vaca, los frutos secos y las frutas, siendo la alergia a las proteínas de la leche de vaca la que afecta a un mayor número de niños (2-3 % de la población infantil). En el caso de identificar el agente alergógeno, el principal tratamiento de la alergia alimentaria es la supresión total del consumo del alimento. En caso de no haber identificado al agente causal, la principal estrategia farmacológica consiste en el empleo de glucocorticoides y antihistamínicos administrados de forma sistémica. Algunos tratamientos específicos del alérgeno consisten en la exposición al mismo por vía oral, sublingual o cutánea para conseguir la desensibilización del individuo. Otras terapias incluyen la utilización de probióticos, proteínas modificadas, terapia anti-IgE, y otras técnicas experimentales que obligan a una investigación constante en la búsqueda de soluciones a una de las más frecuentes enfermedades de hoy en día. La alergia a la leche de vaca durante la infancia parece estar relacionada con la lactancia artificial, ya que la mayor incidencia se encuentra entre niños que no han sido alimentados mediante lactancia materna. Un tema importante es la relación entre la alergia infantil y el desarrollo posterior de otras enfermedades en la edad adulta; la denominada ¿carrera atópica¿ que parece justificar el dato de que entre 30-80% de los niños que han padecido alergia a la leche de vaca en la infancia y/o dermatitis atópica, desarrollan asma u otras alergias respiratorias en la edad adulta. 2. MODELOS ANIMALES La utilización de modelos experimentales en animales persigue la observación de los cambios bioquímicos básicos característicos de las patologías humanas. Debido a las diferencias anatómicas, fisiológicas e inmunológicas entre los animales y el hombre, la interpretación y extrapolación de los resultados debe hacerse con precaución. 2.1 Modelos animales de alergia La mayor parte de la investigación en alergia se hace utilizando ratones como animal de experimentación debido a la disponibilidad de reactivos inmunológicos y de biología molecular, incluyendo animales modificados genéticamente. Otros animales como cobayas, ratas, perros, etc., son poco útiles por la dificultad de manejo. Es importante que el modelo animal sea lo más parecido posible a lo que ocurre en el humano en cuanto a vía de administración del alérgeno, respuesta inmune, reactividad de proteínas (carácter alérgico), ausencia de adyuvantes y propiedades reproducibles. La cepa de ratones Balb/c se usa frecuentemente por su capacidad para desarrollar una respuesta de tipo Th2 frente a numerosos antígenos como ovoalbúmina (OVA), aspergillus, huevo o el polvo doméstico. También son capaces de desarrollar síntomas como diarrea y signos de anafilaxis, además de las respuestas típicas mediadas por mastocitos y eosinófilos, así como la producción de IgE e IgG1. Los protocolos incluyen una fase de sensibilización seguida de otra de re-sensibilización para establecer definitivamente la respuesta alérgica. En las primeras 24 horas tras el segundo contacto, los ratones producen anticuerpos específicos tipo IgE e IgG1 característicos de la respuesta Th2. Se ha investigado la influencia de la vía de administración del antígeno alimentario en la aparición de anticuerpos específicos, encontrándose que la administración intraperitoneal (i.p.) produce una respuesta más intensa que la vía oral, sin embargo, esta vía requiere menor cantidad de alérgeno con un contacto intermitente. Por otra parte, la gran capacidad para desarrollar tolerancia oral en los roedores puede interferir en la respuesta obtenida. Para solventar el problema de la tolerancia oral se suelen utilizar coadyuvantes como el hidróxido de aluminio, la toxina colérica o el adyuvante de Freund, todos ellos destinados a mejorar la respuesta inmunológica de los animales frente al alérgeno administrado. Se observan síntomas generales como la bajada de temperatura, pérdida de peso o diarrea, así como una respuesta Th2 caracterizada por la aparición de IgE e IL-4. También se aprecia la participación de linfocitos Treg en su papel de control de la tolerancia oral y de otras citocinas supresoras de la respuesta inmune como IFN¿, IL-10 e IgA. La mayor limitación de los modelos animales de alergia alimentaria viene de la incapacidad para detectar alérgenos en los alimentos, predecir el poder de nuevas proteínas de alimentos para producir alergia o imitar la sensibilización y respuestas alérgicas en humanos. Dentro de los modelos de alergia alimentaria existen dos muy interesantes como son la alergia inducida por la Ovoalbúmina (OVA) y la alergia a las proteínas de la leche de vaca (APLV). En el caso del modelo de la OVA, se utiliza la proteína del huevo, la OVA, que es uno de los alérgenos mejor conocidos en experimentación animal. Se suele administrar i.p. con un coadyuvante para obtener una buena respuesta alérgica ya que la vía oral da lugar a una reacción menos intensa. El adyuvante suele ser el hidróxido de aluminio (AlOH3) que facilita la respuesta de tipo Th2. Se puede apreciar claramente una elevación de IL-4, IL-5, IL-13 e IL-10 así como la producción de IgE y eosinofilía. Además la elevación de IL-17 demuestra la participación de linfocitos Th17 y Th1 al igual que ocurre en pacientes con alergia. En el caso de la APLV, se administra leche de vaca a ratones con toxina colérica como coadyuvante que estimula la respuesta Th2, incrementa la permeabilidad intestinal y la producción de IgG1. Los ratones recién destetados (Balb/c o C3H/HeJ) se sensibilizan con leche de vaca administrada vía oral semanalmente. A partir de la 3ª semana desarrollan la alergia y a la 6ª semana se obtiene la máxima respuesta. Tras una dosis de carga, este modelo reproduce síntomas generales como el picor, diarrea, pilo-erección, dificultad respiratoria, cianosis, temblor, convulsiones y muerte. 2.2 Modelos animales de inflamación intestinal La mayoría de los modelos animales reproducen una respuesta Th1, por lo que permiten un adecuado estudio de la enfermedad de Crohn. Sin embargo, los modelos con respuesta Th2 para el estudio de la colitis ulcerosa son limitados. Uno de los modelos de IBD más utilizados en ratón es el de la colitis inducida por sulfato de dextrano sódico (DSS). El DSS (2-5%) se administra en el agua de bebida durante 4-9 días produciendo inflamación en el colon que puede ser aguda o bien crónica dependiendo del tipo de tratamiento del DSS y de la cepa de ratón. Los síntomas son similares a la enfermedad humana con presencia de sangre en heces, pérdida de peso, acortamiento del intestino, úlceras en la mucosa e infiltración de neutrófilos. El perfil inmunológico de la inflamación intestinal obtenida es típico de la respuesta Th1/Th17 correspondiente a una inflamación aguda. En el caso de la colitis crónica se puede apreciar una respuesta de tipo Th2. Existe otro modelo de tipo Th1, el modelo de colitis inducida por ácido trinitrobencenosulfónico (TNBS) que ha sido ampliamente utilizado en ratas durante años. Este modelo consiste en la administración intracolónica de TNBS disuelto en alcohol que origina una inflamación aguda en el intestino grueso de los animales con una gran infiltración de linfocitos T y macrófagos, debido a una respuesta típica Th1. Este modelo posee una gran similitud con la enfermedad de Crohn humana como así lo refleja la participación parcial de los linfocitos Th2 observada en ratones IL12-/-. Así mismo, los linfocitos Th17 juegan un importante papel en este modelo experimental. La administración crónica de TNBS puede originar una colitis crónica con presencia de fibrosis intestinal. Por último, en el año 2006, Rijnierse y colaboradores describieron un modelo de colitis con dinitrofluorobenceno/ácido dinitrosulfónico (dnfb/dns) en ratones que presentaba un perfil Th1 especial. El modelo consiste en la sensibilización cutánea de los ratones Balb/c con DNFB, seguida de una dosis intrarrectal de DNS. La respuesta encontrada en los animales entre las 6-72 horas tras el segundo contacto se caracteriza por la activación de mastocitos, acompañada de una producción de TNF¿ en el colon producido por estas células y de la participación de la población de linfocitos T reguladores CD8+CD28-. El problema de este modelo es que no ha sido del todo caracterizado y por tanto no se sabe si reproduce la IBD en humanos ni si puede ser de utilidad. OBJETIVOS Para intentar contestar a los interrogantes que se nos plantearon en un inicio se tuvieron que optimizar modelos animales de distintas patologías y sobretodo optimizar distintos parámetros que nos interesaban para contestar el objetivo general del proyecto. El grupo de Investigación ya disponía de experiencia en varios modelos experimentales en ratón como el del DSS o TNBS de colitis experimental o bien el de la OVA o APLV como modelos de alergia alimentaria. No obstante, se introdujeron adaptaciones en el modelo de la APLV ya descrito y se optimizó un nuevo modelo de colitis experimental. El proyecto se dividió en los siguientes objetivos concretos: OBJETIVO I: Selección de los modelos experimentales a estudiar: A) Establecimiento del modelo experimental de la APLV en ratón con un protocolo más corto. B) Optimización y análisis del modelo de DNFB/DNS en ratón como modelo de inflamación intestinal. OBJETIVO II: Análisis del posible efecto de una inflamación intestinal sobre individuos alérgicos. Así, se analizará el efecto del modelo de DNFB/DNS sobre la incidencia y gravedad de la alergia a la OVA. OBJETIVO III: Evaluación del posible efecto modulador de la APLV sobre segundas patologías. Así, se analizará el efecto de la APLV sobre la incidencia y gravedad de enfermedades como la enfermedad inflamatoria intestinal. RESULTADOS Los resultados de la presente tesis doctoral se han organizado en cuatro apartados, siendo cada uno de estos un artículo original que han sido publicados en diversas revistas científicas o como en el caso del último artículo, se encuentra enviado pero aún no se ha publicado. 1. LA COLITIS INDUCIDA EN RATONES POR DNFB-DNS NO DEBERÍA SER CONSIDERADA UN MODELO DE ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL. (Bailón E, Cueto-Sola M, Utrilla P, Nieto A, Garrido-Mesa N, Celada A, Zarzuelo A, Xaus J, Gálvez J, Comalada M. DNFB-DNS hapten-induced colitis in mice should not be considered a model of inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis. 2011; 17:2087-101.) Ante la ausencia de modelos aceptables para el estudio preclínico de la UC, se investigó el perfil de respuesta inmunológica en el modelo experimental de colitis que emplea DNFB y DNS, propuesto recientemente como modificación de otro ya existente en el que se utilizaba exclusivamente el DNFB como hapteno productor de colitis. Rijnierse y col. describieron en el año 2006 el modelo del DNFB/DNS como un modelo de colitis colónica que estaba asociado con la activación de mastocitos sin participación de macrófagos y donde se demostraba que la expresión de TNF¿ derivada de mastocitos cumplía un papel clave. En nuestro caso nos interesaba encontrar un modelo Th2 para el desarrollo de la presente tesis doctoral con una mayor similitud a la UC, puesto que el modelo del TNBS en ratón era un modelo Th1 y el DSS era un modelo Th1-atípico. Por tanto, decidimos profundizar y optimizar más este modelo. Aunque el modelo experimental original de colitis inducida por DNFB permite el estudio de algunos aspectos de la UC humana, el principal problema que entraña es la dificultad de encontrar una respuesta homogénea entre experimentos. En la mayor parte de los casos se observa una inflamación moderada de la mucosa intestinal, mientras que en otras ocasiones aparece una rápida implantación de la inflamación con intensa hemorragia intestinal y la muerte de muchos animales. El modelo del DNFB/DNS parece permitir una evolución más lenta de la inflamación intestinal y la obtención de resultados más consistentes. Sin embargo, en los animales tratados aparece una alta respuesta de mastocitos sin la participación de macrófagos con un papel predominante de TNF¿. Debido a la escasez de datos aportados por Rijnierse y col. que profundizaran en dicho modelo experimental, llevamos a cabo una exploración del perfil inmunológico de esta propuesta con el fin de afianzar su utilidad en el estudio de la UC. Para llevar a cabo el estudio se desarrollaron distintos experimentos con ratones machos Balb/c. En el primer experimento se valoró la colitis inducida tras la sensibilización de los animales en el día 0 por la administración de forma tópica de DNFB en el abdomen rasurado y en las patas, un segundo contacto con DNFB el día 1 en el abdomen y el día 5 se realizó la re-sensibilización vía rectal con DNS. Los grupos experimentales fueron: i) sano, ii) DNFB/DNS, iii) DNFB, iv) DNS. Los ratones se sacrificaron los días 1, 2, 3, 5 y 7 tras la re-sensibilización. En un segundo experimento se estudió la colitis que se desarrollaba al administrar una segunda re-sensibilización rectal con DNS el día 15. Los animales se sacrificaron tras 24-72 horas de esta segunda administración intrarrectal. Finalmente, se realizó un tercer experimento en el que se provocaba la colitis con la administración rectal de TNBS, modelo típico de respuesta Th1 y que lo utilizamos como control para comentar ambos modelos. Los cambios observados por el modelo del DNFB/DNS en ratones Balb/c en el tejido del colon se corresponden con una inflamación moderada del intestino si lo comparamos con la inflamación provocada por el TNBS, y que se resuelve espontáneamente en menos de 5 días. Además, de forma similar a lo publicado para el modelo de DNFB, el inicio de la colitis es poco homogéneo, siendo inexistente en el 10% de los animales y letal para el 30-40%. El análisis microscópico confirma una escasa infiltración de macrófagos, sugiriendo una mayor participación de los linfocitos T y B en el proceso inflamatorio, como lo indica el mayor número de lesiones observadas en el intestino grueso en comparación con el protocolo del TNBS y confirmado por la inmunohistoquímica. La contribución de los mastocitos en este modelo es muy modesta, a pesar de lo publicado con anterioridad. Estos resultados son acordes con la mínima presencia de histamina en el plasma durante la fase inflamatoria. Al contrario de lo que ocurre en otras especies animales (hombre, rata, etc.), en las que los mastocitos juegan un importante papel durante la inflamación, en el ratón se ha descrito una mínima contribución en distintos modelos animales a menos que exista una infección por nematodos. La presencia de TNF¿ es insignificante después de la re-sensibilización con DNS, mientras que IL-2 e IL-5 están muy aumentadas, un escenario muy diferente al expuesto por los autores que desarrollaron el modelo experimental, algo de difícil explicación. La escasa presencia de macrófagos puede justificar la ausencia de TNF¿, aunque los niveles de esta citocina no se correlacionan con el grado de la enfermedad, ni siquiera en humanos. Los altos niveles de IL-5 pueden tener un origen linfocitario y, aunque su papel no está completamente dilucidado en la inflamación intestinal, parece que cumple funciones reguladoras de linfocitos B y la producción de anticuerpos, aunque la ausencia de esta citocina no altera la evolución de la enfermedad. La evaluación de la respuesta humoral del modelo tampoco coincide con la expuesta por los autores avalistas, ya que fue expuesto como IgE independiente, mientras que se han encontrado niveles elevados de IgE tanto en plasma como en colon, y una expresión retardada de IgA. Debido a todo lo anterior, este modelo experimental no debe ser considerado válido para el estudio de la enfermedad inflamatoria intestinal, teniendo en cuenta que la inflamación moderada que produce la presencia del hapteno no es suficiente para provocar la pérdida de la integridad de la mucosa intestinal que permita la infiltración de antígenos luminales y ponga en marcha la respuesta de la inmunidad adquirida. Además, la inflamación se resuelve espontáneamente en los primeros 5 días sin capacidad para agudizarse tras una segunda re-sensibilización con el antígeno. A pesar de ello, este modelo aporta una respuesta inflamatoria similar a la hipersensibilidad retardada de contacto, con la participación de linfocitos T y B y la respuesta humoral en un papel predominante, como se ha demostrado en modelos de dermatitis de contacto provocada por DNFB. Debido a la complejidad de la respuesta encontrada en este modelo experimental, se puede deducir que se asemeja más a situaciones de alergia alimentaria con respuestas IgE-dependientes e independientes, así como a la respuesta del síndrome de intestino irritable (IBS), una patología que también requiere de nuevos modelos experimentales para su estudio. La optimización que hemos llevado a cabo de este modelo nos ha servido de base para posteriores estudios de la presente tesis doctoral. Es el caso de la evaluación de cómo la colitis influye en la alergia alimentaria (ver artículo 3) o del papel que tiene la alergia alimentaria a la leche de vaca en ratones sanos sobre la inflamación intestinal (ver artículo 4). 2. MODELO EXPERIMENTAL BASADO EN LA SENSIBILIZACIÓN ORAL, MÁS CORTO Y ESPECÍFICO, DE ALERGIA ALIMENTARIA EN RATONES. (Bailón E, Cueto-Sola M, Utrilla P, Rodríguez-Ruiz J, Garrido-Mesa N, Zarzuelo A, Xaus J, Gálvez J, Comalada M. A shorter and more specific oral sensitization-based experimental model of food allergy in mice J Immunol Methods. 2012; 381:41-9.) Los modelos animales de alergia en ratas o ratones nos permiten estudiar nuevos abordajes terapéuticos y los mecanismos moleculares involucrados en la enfermedad. Sin embargo, en los modelos establecidos hasta hoy día, la sensibilización oral de alimentos en ratones requiere varias semanas y están asociados habitualmente a respuestas inmunológicas inespecíficas, por lo que ningún modelo animal en ratones resulta aceptable completamente, ya sea para la alergia a la leche de vaca u otras alergias alimentarias. Los modelos descritos utilizan varias vías de administración, diferentes coadyuvantes, tipos de antígenos, dosis y duración del periodo de sensibilización. El principal obstáculo en todos ellos es la capacidad innata de los ratones para desarrollar tolerancia oral a antígenos digestivos y por tanto se necesitan largos periodos de sensibilización. Por ello, el principal objetivo que nos planteamos fue optimizar un protocolo de alergia alimentaria a la leche de vaca (CMPA) que fuera más corto que el descrito previamente en la literatura pero que presentara características similares. Para ello se emplearon ratones hembra Balb/c y comparamos 2 protocolos, uno que llamamos ¿protocolo largo¿ que consiste en un modelo convencional de alergia a la leche ya descrito previamente y que consta de 6 semanas de sensibilización oral y de una re-sensibilización también por vía oral. Y un segundo esquema, propuesto por nosotros, que llamamos ¿protocolo corto¿ donde el periodo de sensibilización constaba sólo de 2 semanas aunque la re-sensibilización debía hacerse por vía i.p. El estudio se ha llevado a cabo con varios grupos experimentales: i) sano, ii) sensibilizado 6 semanas + re-sensibilización, iii) toxina colérica 6 semanas, iv) no sensibilizado 6 semanas + re-sensibilización, v) sensibilizado 2 semanas + re-sensibilización, vi) toxina colérica 2 semanas, vii) no sensibilizado 2 semanas + re-sensibilización. En el protocolo original largo se realiza una sensibilización oral con proteína de leche de vaca más toxina colérica como coadyuvante durante 6 semanas (una vez por semana) y una re-sensibilización oral el día 48, mientras que en el protocolo corto se hace una sensibilización vía oral cada 3 días durante 2 semanas y una re-sensibilización i.p. el día 18. Los grupos no sensibilizados pero que reciben la re-sensibilización así como los que reciben solo toxina colérica sirven de control. Según nuestros resultados, la administración de toxina colérica a los animales de experimentación, en ausencia de proteína de leche de vaca, provoca una respuesta inmune no selectiva caracterizada por diarrea, edema de colon, agrandamiento del bazo, aumento de histamina plasmática, producción de IL-4 y aparición de IgG1, IgE o IgG2a. El mecanismo de esta inducción inmunológica de tipo Th2 todavía no está completamente dilucidado y así, se han encontrado resultados contradictorios, con una supresión de la respuesta inmune en lugar de inducción cuando se promueve la secreción de IgA o una respuesta de IgG2a asociada a Th1. La observación de una respuesta inmune reducida en los animales tratados exclusivamente con toxina colérica podría deberse, no a un efecto directo sino a la elevación de una respuesta alérgica a otros antígenos alimentarios presentes en la dieta, un proceso que probablemente necesitará más de 2 semanas para llevarse a cabo. En este aspecto, la proteína de la leche de vaca sola, necesita de al menos 5 semanas para inducir una reacción alérgica, según otros autores. También se ha publicado una reactividad cruzada entre las proteínas de soja y la de la leche de vaca en animales de experimentación, lo cual puede justificar algunos de los resultados encontrados en este experimento. Los datos encontrados demuestran que el nuevo protocolo presenta algunas ventajas respecto a los otros métodos publicados. En resumen, se reduce el tiempo de experimentación en dos tercios, el grupo control con toxina colérica sola no interfiere en la interpretación de los resultados, permitiendo alcanzar significación en parámetros cruciales de la alergia como el score clínico o los niveles de IL-4. Por último, la respuesta obtenida es más específica de antígeno que la encontrada en el protocolo original ya que no se incrementa la cantidad de inmunoglobulinas totales en plasma o colon, mientras que se produce un incremento claro en la cantidad de IgG1 específica de la proteína de la leche de vaca, un hecho característico de la respuesta alérgica. Un posible argumento en contra de este nuevo método sería la utilización de una re-sensibilización i.p. para conseguir una respuesta óptima. Aunque esta vía de administración no es la más fisiológica para el estudio de la alergia a la leche de vaca, es la mejor opción para poner mínimas cantidades de antígeno en los animales, consiguiendo el mantenimiento de una respuesta específica de antígeno. Si se utilizara la vía oral para la re-sensibilización se necesitarían grandes cantidades de proteína para asegurar la absorción de una cantidad suficiente de proteína intacta. Algunos autores proponen la utilización de inhibidores de la secreción gástrica para conseguir el mismo objetivo, sin embargo se puede perder la selectividad del antígeno. También se observa una ausencia en las diferencias de IgE producida tanto en plasma como en colon, siendo esta inmunoglobulina de vital importancia en la alergia. Sin embargo ya se ha comunicado una pérdida de la respuesta dependiente de IgE en la alergia a la leche de vaca y otros antígenos alimentarios, puesto que la aparición de IgE depende del tipo de antígeno utilizado. Por ello, el resultado encontrado en el protocolo convencional puede deberse a la presencia de otros antígenos en la alimentación. Por último, la ausencia de IgA en el protocolo corto puede explicarse por la brevedad del mismo, sin embargo este hecho puede resultar beneficioso ya que esta inmunoglobulina podría bloquear el efecto de las otras. En conclusión, el nuevo modelo desarrollado para el estudio de la alergia a la proteína de la leche de vaca que requiere solo 2 semanas de sensibilización, produce una respuesta inmune más intensa, específica y selectiva frente al antígeno utilizado. Por tanto favorece la consistencia de los resultados y permite la reducción del número de animales utilizados. Este modelo fue empleado para evaluar la respuesta inflamatoria en animales que presentaban atopia a la CMP (ver artículo 4). 3. LA COLITIS ACTIVA INCREMENTA LA RESPUESTA INMUNE A ANTÍGENOS ALIMENTARIOS EN RATONES. (Cueto-Sola M, Bailon E, Utrilla P, Rodríguez-Ruiz J, Garrido-Mesa N, Zarzuelo A, Xaus J, Gálvez J, Comalada M. Active colitis exacerbates immune response to internalized food antigen in mice. Int Arch Allergy Immunol. 2013; 162:214-24.) Debido a las condiciones particulares que genera la enfermedad inflamatoria intestinal (IBD) en el aparato digestivo, se sospecha que se puede ver agravada una respuesta alérgica a alimentos. Sin embargo, la diferente especialización de la respuesta inmune en ambas patologías, Th1 en IBD y Th2 en alergia, pone en entredicho la posibilidad de que exista una interrelación entre ambas. Hasta el momento no se conoce cómo la sensibilización a antígenos alimentarios puede estar relacionada con la inflamación intestinal, sin embargo, en casi un tercio de los pacientes con IBD aparecen síntomas de la enfermedad como consecuencia del consumo de algún alimento. Así, la eliminación de la dieta de algunos alimentos como leche, huevos o pescado resulta en un beneficio evidente para el paciente. Por tanto, el objetivo fundamental que nos propusimos fue analizar la posible relación existente entre la respuesta alérgica alimentaria y la inflamación intestinal usando métodos experimentales sencillos. Para ello, utilizamos un modelo de colitis (DNFB/DNS) y un modelo de alergia basado en la sensibilización y re-sensibilización con OVA i.p. y los combinamos (ver Figura 1). En ambos modelos la respuesta inmunológica es simple y reproducible, además, la administración i.p. del alérgeno permite conocer exactamente la cantidad que llega al interior del animal. Figura 1. Esquema del protocolo empleado. (i.p.: intraperitoneal; IR: intrarrectal) A modo de resumen (ver Figura 1) se planteó un estudio con diversos grupos experimentales: i) sano, ii) OVA, iii) DNS y iv) OVA + DNS. Se emplearon ratones hembra Balb/c. Para la inducción de la alergia se utilizó OVA administrada vía i.p. con hidróxido de aluminio como coadyuvante. Cinco días después de la sensibilización con OVA se realizó la sensibilización con DNFB por vía tópica en el abdomen rasurado y las patas; el día 6 se administró sólo DNFB en el abdomen y el día 10 se realizó la re-sensibilización intrarrectal (IR) con DNS. Finalmente, el día 14 se procedió a la re-sensibilización con OVA administrada i.p. La relación entre ambas patologías puede explicarse por tres factores principalmente. El primero son las alteraciones de la mucosa intestinal y la mayor permeabilidad que ocurre durante la inflamación intestinal que facilita la entrada de antígenos y el desencadenamiento de los síntomas, fundamentalmente en sujetos sensibilizados por factores ambientales. Sin embargo, esta hipótesis no solo no ha sido confirmada en ningún estudio, sino que se ha refutado en otros. Además, la variabilidad en la ruptura de la barrera intestinal de los distintos modelos experimentales hace que la interpretación de los resultados sea difícil. Por ello, se usó el modelo del DNFB/DNS en el cual se provoca una inflamación moderada que no altera la integridad de la mucosa. En segundo lugar, se ha postulado como punto de relación entre las patologías, una posible reactividad cruzada entre los anticuerpos específicos de antígeno de la alergia y los anticuerpos generados durante la inflamación intestinal. Dicha relación se ha encontrado, por ejemplo, en la diabetes tipo I. La probabilidad de que se origine dicha interacción en nuestros modelos experimentales es mínima debido a la naturaleza de los agentes causantes de la enfermedad DNFB y OVA. Además, observando los resultados obtenidos del estudio ¿in vitro¿, la respuesta que desencadenan los linfocitos tras la estimulación con OVA denota que es específica para este antígeno y no como consecuencia de una reacción cruzada con el DNFB/DNS. Por último, se ha sugerido que la especialización de la respuesta inmune de la alergia y la inflamación intestinal pueden ser responsables de la interrelación. Las citocinas y factores de crecimiento originados como IL-3, IL-5 y GM-CSF de eosinófilos e IL-4 de mastocitos que se generan durante la UC contribuyen de forma crucial en los síntomas de la alergia ya que son claves para el desarrollo y el reclutamiento de las células efectoras de la alergia así como de su funcionalidad y la liberación de mediadores. Así, los pacientes con UC sufren con más frecuencia alergia alimentaria que los enfermos de CD debido a su comportamiento mayoritariamente Th2. A este respecto, el modelo de colitis empleado tiene una respuesta Th2 atípica y genera también mecanismos Th1 reflejando la complejidad de la enfermedad humana. Sin embargo, el modelo empleado no es completamente satisfactorio. Así, la inyección i.p. de OVA provoca una sintomatología alérgica tan intensa que no se observan diferencias clínicas entre los grupos colíticos y no colíticos. Además, se aprecia una distensión en el intestino delgado, en ambos grupos tratados, de etiología desconocida y por último, hay una pobre respuesta sistémica no relacionada con la producción de IgE, algo que, por otra parte, ha sido descrito en algunos modelos de alergia alimentaria. A pesar de las pequeñas sombras de los modelos experimentales usados, los resultados obtenidos demuestran que la especialización en la respuesta inmune es el principal punto de conexión entre la alergia y la inflamación intestinal. El proceso colítico y la particular respuesta originada durante la sensibilización con DNFB/DNS producen factores que estimulan y refuerzan el mantenimiento y prolongación de las células generadas durante la inducción de la alergia a OVA. El incremento de la respuesta linfocitaria observado ¿in vitro¿ tras la estimulación por OVA en los grupos OVA + DNS en comparación con los otros grupos experimentales apoya esta hipótesis. Además, la participación de la inmunidad adquirida en la respuesta exagerada se puso en evidencia también por el agrandamiento del bazo y la mayor producción de IL-2. En conclusión, los resultados encontrados sugieren que se produce una mayor respuesta alérgica específica de antígeno en los animales con colitis. Esta observación es importante para reducir el riesgo de anafilaxis en los pacientes co-diagnosticados de IBD y alergia alimentaria en los cuales aparece alta reactividad inmunológica y permeabilidad intestinal elevada. 4. LOS RATONES ATÓPICOS MUESTRAN UNA RESPUESTA INMUNE AUMENTADA O REDUCIDA DURANTE LA COLITIS, DEPENDIENDO DEL MODELO ANIMAL USADO. (Cueto-Sola M, Utrilla P, Bailon E, Garrido-Mesa N, Rodriguez-Ruiz J, Vidald JM, Zarzuelo A, Xaus J, Galvez J, Comalada M. Atopic mice show an increased or reduced immune response during colitis depending on the animal model used. Pendiente de publicación) La alergia alimentaria originada en la infancia, sobre todo la alergia a la proteína de la leche de vaca, se relaciona frecuentemente con el riesgo de sufrir otras enfermedades alérgicas en la edad adulta como asma, rinitis o dermatitis atópica. Esta evolución se ha denominado ¿carrera atópica¿. El incremento en la permeabilidad intestinal que se origina en la alergia alimentaria y que perduraría durante toda la vida, podría considerarse relacionada con el origen de patologías como la IBD o el IBS. De hecho, la coexistencia de ambas enfermedades es cada vez más frecuente en los últimos años. La relación entre IBD y alergia en humanos ha sido ya demostrada, pero respecto al IBS, los enfermos relatan una cierta intolerancia a algunos alimentos aunque no se ha podido constatar dicha relación. A pesar de los numerosos estudios realizados, todavía no se ha puesto en evidencia experimentalmente una mayor tendencia a sufrir colitis en individuos atópicos. En estudios anteriores, utilizamos un modelo combinado de alergia alimentaria y colitis para demostrar que los síntomas de la alergia eran más notables cuando se sufría una colitis activa (ver artículo 3). En este trabajo los objetivos eran, en primer lugar establecer un modelo animal que se asemejara a la atopia en adultos y posteriormente observar como esta condición puede alterar la respuesta a la inflamación intestinal provocada por haptenos como DSS y DNFB/DNS. Se utilizaron ratones hembra Balb/c para establecer el modelo de atopia en ratones. Para ello se inició la alergia a la proteína de la leche de vaca a las tres semanas de edad con ratones recién destetados siguiendo el ¿protocolo corto¿ que se puso a punto en nuestro laboratorio y que se ha discutido anteriormente (ver artículo 2) aunque con algunas pequeñas modificaciones. La re-sensibilización fue realizada el día 18 y 24 horas más tarde un grupo de animales (grupo de ¿alergia aguda¿) fue sacrificado para constatar el estado de alergia deseado. Otro grupo de animales (grupo de ratones ¿atópicos¿) se sacrificaron el día 34 con el fin de demostrar que el estado de alergia se mantenía, asemejándose a la atopia en humanos. Tras esto, con ratones atópicos se inició el experimento de colitis con dos modelos experimentales: colitis inducida por DNFB/DNS, modelo caracterizado por una diarrea con escasa influencia en la permeabilidad intestinal que podría relacionarse con IBS en humanos, y colitis inducida por DSS, modelo experimental para IBD. En este último caso se provocó una colitis moderada utilizando DSS al 1,5% y una colitis severa con la utilización de DSS al 3,0%, en ambos casos incorporado al agua de bebida durante 5 días. Los resultados obtenidos en el caso del modelo de atopia adulta en ratones han permitido constatar la presencia de IgE plasmática que se acompaña de una ligera alteración intestinal como se demuestra con la disminución de la relación peso/longitud tanto del intestino delgado como del colon, a pesar de la ausencia de síntomas de alergia y otras alteraciones macroscópicas como el peso de los animales, consumo de comida o consistencia de las heces. Todo ello refleja que la alergia originada en la infancia produce un daño permanente en el intestino que se prolonga hasta la edad adulta. En el caso de la colitis inducida a los animales atópicos, la respuesta encontrada en los dos modelos experimentales utilizados es diferente. En la colitis por DSS, los animales atópicos han demostrado una sintomatología mucho menos aguda que los no atópicos, tanto en la colitis moderada como en la severa. Sin embargo, el modelo de colitis inducida por DNFB/DNS provoca una mayor respuesta diarreica en los animales atópicos que en los sanos. La diferente respuesta encontrada puede deberse al distinto mecanismo inmune que acompaña a los haptenos empleados en su proceso inflamatorio. Así, el DSS es capaz de provocar una respuesta preferentemente Th1, por tanto la respuesta Th2 observada en el proceso atópico podría atenuar la expresión de citocinas de tipo Th1 requeridas para el inicio del estado inflamatorio en este modelo DSS, debido a la competencia existente entre ambas derivaciones de la respuesta inmune. Mientras, la colitis inducida por DNFB/DNS se caracteriza por una inflamación mediada por linfocitos Th2 que podría sumarse a la respuesta alérgica que sigue el mismo modelo de respuesta. Como conclusión, puede afirmarse que las alteraciones intestinales e inmunes observadas en el modelo de atopia desarrollado, pueden modificar la respuesta de inflamación intestinal, en un sentido u otro, según el modelo experimental utilizado, por ello, es muy importante la elección del modelo animal y se debe ser cauto a la hora de extraer conclusiones y de extrapolar los resultados a la especie humana. DISCUSIÓN Desde hace tiempo se viene observando que en los países más industrializados cada vez hay una mayor prevalencia de enfermedades sobre todo de tipo inflamatorio y aunque la causa no está clara, parece que hay diversos factores implicados. Uno de los aspectos que podrían participar en el desarrollo de estas enfermedades es la pérdida de la tolerancia. La tolerancia es clave para mantener una relación adecuada entre el exterior (o lo ajeno) y el interior (o lo propio) sin que se desencadene una respuesta inmune excesiva, por falta de tolerancia, ni haya una infección, por exceso de tolerancia. Tanto en la respuesta inmune como en la alergia están implicadas la respuesta celular y la humoral, pudiendo diferenciarse dentro de esta última la presencia de anticuerpos específicos de antígeno. Aunque aún no se ha podido demostrar de manera experimental, hay muchas evidencias y estudios retrospectivos donde se ha visto una relación entre pacientes que han sufrido una alergia en la edad temprana y que luego en la etapa adulta han desarrollado IBD. Sin embargo en el caso de la CD y UC no está tan clara esta relación como en el caso de la dermatitis atópica y la alergia. Por otra parte, no se ha publicado hasta ahora la recreación de las condiciones de dos patologías diferentes como la alergia y la IBD en un mismo animal de experimentación. Esto puede deberse a varias complicaciones como la elección del modelo animal y la compleja interpretación de resultados. Con este fin en mente, llevamos a cabo la optimización de un modelo de alergia alimentaria y un modelo de inflamación intestinal por separado para luego estudiar estas condiciones de forma conjunta en dos modelos mixtos. En primer lugar, pretendíamos encontrar un modelo animal de IBD que nos permitiera evaluar la relación entre la alergia y la IBD. Para alcanzar este objetivo, analizamos el perfil inmunológico del modelo del DNFB/DNS descrito por Rijnierse en 2006. Además comparamos este modelo con el modelo del TNBS que es un protocolo ampliamente estudiado de CD. En el modelo del DNFB/DNS observamos que tanto la diarrea como la inflamación asociada a esta eran de intensidad media y prácticamente desaparecían en el día 5. Por otro lado la activación y desgranulación de mastocitos y la expresión de citocinas fue moderada. Sin embargo sí que se vio un aumento en IL-2 e IL-5 con una mínima participación de TNF-¿. En cuanto a la respuesta humoral, observamos un aumento tanto en colon como en plasma de IgE e IgG1 mientras que IgA estaba aumentada en colon y disminuida en plasma. Esto nos hace pensar que la respuesta inmune en este modelo está mediada principalmente por células B. La participación de IL-5 podría hacernos pensar que se trata de un modelo que se asemeja a la UC humana pero observando todos los resultados en conjunto la conclusión es diferente. Aunque no sea un modelo adecuado para el estudio de la IBD sí podría serlo para otras enfermedades con respuestas intestinales alérgicas. Elegimos este modelo para llevar a cabo alguno de nuestros objetivos por su reacción inflamatoria moderada y su respuesta simple de citocinas. Por otro lado buscábamos un modelo adecuado de alergia alimentaria. Hay modelos con diferentes alergenos, entre los que destaca la ovoalbúmina (OVA) que desencadena una respuesta fuerte, reproducible y bien caracterizada; y la proteína de leche de vaca (CMP) que requiere ratones recién destetados, los resultados no tienen una tasa muy alta de reproducibilidad y desarrolla una respuesta lenta con un pico a las 6 semanas. Sin embargo este modelo que había sido reevaluado por Lara-Villoslada y col. en 2004 tenía como ventajas que los síntomas sistémicos eran similares a la alergia humana. Así que nos propusimos mejorar este modelo con una reducción significativa en el tiempo necesario (2 semanas versus 6 semanas) para que se obtenga la respuesta alérgica junto con una respuesta incrementada. Una de las innovaciones fue la administración intraperitoneal de CMP en el momento de la re-sensibilización que aunque podría considerarse que no es una opción muy fisiológica sí que permite la administración de cantidades mínimas de la proteína intacta consiguiendo una respuesta más específica. También comprobamos el papel que tenía la toxina colérica tanto en el modelo de 6 como en el de 2 semanas, viendo que incrementa significativamente algunos de los marcadores de respuesta alérgica. En cuanto a la respuesta humoral, vimos que en nuestro protocolo no se veían aumentados los niveles de IgE (CMP no siempre es efectiva aumentando IgE) y tampoco los de IgA (podría ser una ventaja ya que la acción de IgA es contraria a la del resto de Igs). Una vez llegados a este punto, nuestro objetivo era estudiar de forma combinada ambas patologías y para conseguir esto había que conseguir una buena correlación temporal y una respuesta inmune claramente establecida con las mínimas interferencias posibles. En el modelo combinado de OVA y DNFB/DNS, se vio un aumento de la respuesta humoral en los grupos que combinaban alergia alimentaria y modelo de inflamación intestinal. Esto también ocurrió con la respuesta celular, principalmente Th2, donde se vio el aumento de IL-2, IL-4 e IL-5. En la última parte de la tesis, estudiamos la influencia que podría tener la atopia en los síntomas de dos modelos: DSS (modelo que se asemeja a IBD humana) y DNFB/DNS (similar a IBS). La importancia de esto no solo fue el establecimiento de un modelo animal atópico adulto sino también la combinación con un modelo experimental de colitis y la interrelación de ambos resultados para estudiar la importancia de la situación atópica desarrollada en la infancia con el posterior desarrollo de procesos colíticos en el adulto. El modelo de ratón atópico adulto empleado fue el protocolo corto de CMPA comentado anteriormente que nos permitía reproducir un estado atópico 35 días después de la primera sensibilización con CMP junto con toxina colérica. Los resultados obtenidos indicaban una condición muy parecida a la situación atópica en humanos. Una vez adoptado este modelo, para ver la respuesta de individuos atópicos a una nueva agresión de tipo inflamatorio utilizamos en estos mismos ratones dos modelos diferentes de colitis inducida por haptenos (DSS y DNFB/DNS). En el modelo del DSS se observó una clara reducción de la respuesta inmune en ratones atópicos (CMPA) tanto en la concentración de DSS al 1,5% como al 3,5% aunque en cuanto al comportamiento humoral no se pudo extraer ninguna conclusión clara en este modelo combinado. Para clarificar esta respuesta inmune se diseñó otro experimento combinado con CMPA y DNFB/DNS. En este caso, al contrario de lo que ocurría con el DSS, se vio una potenciación de la colitis en ratones atópicos. En la respuesta humoral se vio un aumento de IgE en colon y en plasma y una disminución de IgA en colon. La posible explicación para estos comportamientos opuestos es que el modelo del DSS se caracteriza por una respuesta Th1/Th17 que podría competir con la respuesta Th2 característica de la atopia. Sin embargo el modelo DNFB/DNS induce una reacción de hipersensibilidad en el colon con un patrón de citocinas típico de una respuesta Th2 que se potenciaría con la respuesta de la atopia. Por tanto y como conclusión, en la presente tesis doctoral hemos ampliado el análisis y la optimización de dos modelos animales, uno de alergia alimentaria (CMPA) y otro de inflamación intestinal (DNFB/DNS). Además hemos dejado patente la importancia de la selección del modelo para la demostración de la hipótesis de estudio puesto que en función del modelo elegido se puede tener una respuesta u otra. Es importante destacar que no ha sido una tarea fácil por cuestiones diversas como tener que cumplir con las normas éticas de experimentación animal al utilizar varios protocolos simultáneamente. Y finalmente, por primera vez hemos demostrado, mediante la utilización simultanea de distintos modelos animales, que se pueden contestar preguntas como las que nos hacíamos inicialmente en esta tesis. CONCLUSIONES Las conclusiones que hemos podido extraer de este trabajo de tesis doctoral son: CONCLUSIÓN I: Optimización de varios modelos de experimentación animal: C) Se ha desarrollado un modelo más corto de CMPA con las siguientes ventajas: o Se consigue una respuesta inmune más intensa, más específica y más dirigida al antígeno, lo que favorece la consistencia de los resultados. o Permite conseguir una disminución del coste del experimento al reducir el tiempo y el número de animales necesarios. o Al reducirse el tiempo de sensibilización también disminuye la exposición al adyuvante (toxina colérica) con lo que la respuesta de los grupos control no interfiere en la interpretación de los datos. D) Se ha optimizado el modelo del DNFB/DNS, que originalmente se había descrito como un modelo de enfermedad inflamatoria intestinal. Las principales conclusiones son: o Este modelo no debería ser considerado como un modelo de IBD, sino más bien como un modelo del síndrome del intestino irritable, donde los modelos animales escasean. o Las respuestas T y B y la humoral tienen un papel clave en este modelo. o Que sea un modelo de inflamación aguda que vuelve rápidamente a valores basales permite usar otro modelo a continuación en el mismo animal sin que haya interferencias. CONCLUSIÓN II: Mediante el estudio de la posible influencia de la inflamación intestinal (modelo DNFB/DNS) en individuos alérgicos (modelo OVA) hemos demostrado que: o Hay una respuesta específica de antígeno incrementada en animales con colitis. CONCLUSIÓN III: Se ha evaluado el efecto modulador de la CMPA en otras patologías intestinales con un componente inmune, utilizando los modelos CMPA, DSS y DNFB/DNS probándose que: o El proceso atópico de CMPA atenúa la respuesta observada en el modelo del DSS. o El proceso atópico de CMPA aumenta la respuesta observada en el modelo del DNFB/DNS.