Estructura y expresión del ADN ribosómico de los cromosomas B del saltamontes eyprepocnemis plorans

Resumen

Introducción: En los genomas eucarióticos existen elementos genéticos egoístas que se comportan como parásitos intragenómicos cuyo número de copias se multiplica por mecanismos ajenos a las leyes mendelianas y, en muchos casos, siendo deletéreos para los genomas hospedadores. Entre éstos podemos citar a los transposones, los distorsionadores de la segregación, algunos factores citoplasmáticos y los cromosomas B. Estos últimos fueron descubiertos hace más de un siglo por Wilson (1906), al observar un cromosoma extra en el hemíptero Metapodius que, años más tarde, fue considerado un parásito genómico (Östergren, 1945). A estos cromosomas se les ha denominado cromosomas B para distinguirlos de los cromosomas A o estándar (Randolph, 1928). Los cromosomas B se han encontrado formando parte del genoma de algunos individuos en algunas poblaciones de 10 especies de hongos, 1300 de plantas y en más de 500 especies animales (Jones y Rees, 1982, Jones 1995, Camacho 2005). Se definen como ¿cromosomas dispensables que no recombinan con los cromosomas A y que siguen modos de herencia no mendelianos¿ (Jones, 1995). Estas características hacen que sigan procesos de diferenciación y una dinámica evolutiva independiente de la de los cromosomas A entablándose, en muchos casos, una carrera de armamentos similar a la que se produce entre parásitos y hospedadores (Camacho 2005). La naturaleza de los cromosomas B es en su mayoría heterocromática, estando formados principalmente por ADN satélite, ADN ribosómico y elementos móviles, estando sujetos frecuentemente a una serie de modificaciones epigenéticas. Eyprepocnemis plorans es una especie de insecto ortóptero muy frecuente en la Península Ibérica, especialmente en zonas costeras mediterráneas, desde Tarragona hasta Huelva, adentrándose también hacia regiones interiores a lo largo de las cuencas de los principales ríos mediterráneos. La gran mayoría de las poblaciones españolas analizadas hasta ahora poseen cromosomas B, con la única excepción de las poblaciones situadas en las cabeceras de los ríos de la cuenca del Segura (Cabrero y col., 1997). En las poblaciones españolas se han descrito distintas variantes para este cromosoma: B1, B2, B5 y B24. El cromosoma B1 es el más ampliamente distribuido por la Península Ibérica, por lo que se le considera el ancestral (Henriques-Gil y Aranda, 1990). La existencia de otras variantes, que predominan en algunas poblaciones, indica que se han producido fenómenos de sustitución de una variante por otra, como es el caso de B2 que ha sido sustituido por B24 en la población malagueña de Torrox (Zurita y col., 1998). El bloque ribosómico 45S se encuentra repetido en tándem en la mayoría de los organismos eucariotas (Long y David, 1980), formando las regiones organizadoras nucleolares (NORs) de los cromosomas. La unidad de transcripción está formada por los genes 18S, 5,8S, y 28S, separados entre ellos por los ITS (ITS1, ITS2). La activación de estos genes conduce a la formación de nucleolos. En la mayoría de los casos, el ADNr de los Bs está inactivo (Cabrero y col., 1987), sin embargo, recientemente, Teruel y col. (2007) han observado la formación de nucleolos por el ADNr de los cromosomas B en varios individuos de la especie de saltamontes E. plorans de la población de Torrox, capturados en 1999. En muestras de 2003 y 2004, había una mayor proporción de individuos expresando el ADNr del B, por lo que parece que el fenómeno está en expansión (Teruel y col., 2009). Y es que ellos además descubrieron que la secuencia del ITS2 del cromosoma B del saltamontes E. plorans muestra la inserción de una adenina, que no tienen el resto de ITS2 de los cromosomas de su genoma. Esta diferencia de una base será utilizada para diferenciar los transcritos procedentes de dicho cromosoma. En la presente tesis doctoral hemos analizado la estructura y activación/expresión del ADNr del cromosoma B en Eyprepocnemis plorans. Objetivos y metodología: 1) Hemos desarrollado un procedimiento molecular que permite obtener y cuantificar los transcritos de ADNr procedentes del cromosoma B de E.plorans. Utilizamos la inserción de la adenina para diferenciar los transcritos procedentes de dicho cromosoma y ver si era transcripcionalmente activo en la población de Torrox (Málaga, España). Se realizó primero un estudio en el que analizamos citogenéticamente, mediante impregnación argéntica, la expresión de las NORs en individuos de esta población para después corroborar los resultados molecularmente. Esta segunda parte se abordó diseñando cebadores que amplificaban específicamente el ITS2 del cromosoma B. 2) Caracterizamos mediante doble FISH, con sondas de ADNr y ADNsat, los tipos de Bs existentes en poblaciones de la región mediterránea occidental, con el fin de seleccionar un grupo de poblaciones con diferentes tipos de cromosomas B (ver siguiente objetivo). 3) Analizamos diferentes poblaciones de E.plorans, para ver si las otras variantes de cromosoma B también habían empezado a expresar su ADNr. Lo abordamos citogenéticamente (con impregnación argéntica) y molecularmente, tratando de detectar los posibles transcritos que hubieran mediante PCR. 4) Averiguamos si el cromosoma B de E.plorans si está presente en diferentes partes corporales. Lo haremos molecularmente usando unos marcadores específicos del B, realizando PCR en diferentes partes del cuerpo del saltamontes y en diferentes sexos. 5) Para averiguar si los cromosomas B de E. plorans son mitóticamente estables, es decir, si se encuentran en el mismo número en todos los tejidos de un mismo individuo, intentaremos cuantificar el número de copias del ADNr específico del cromosoma B en diferentes machos de dos poblaciones diferentes, así como en diferentes partes del cuerpo de varios individuos. Para ello, utilizaremos el método molecular anteriormente descrito pero, en este caso, cambiando el cebador forward para que el fragmento amplificado sea de menor tamaño y se ajuste así a los requerimientos técnicos de la PCR cuantitativa (qPCR). 6) Estudiar la expresión del ADNr del cromosoma B de E.plorans de la población de Torrox, en diferentes partes del cuerpo. Así, veremos si dicha expresión es un fenómeno ubicuo o bien está restringido a algunas partes el cuerpo. Nos proponemos además cuantificar mediante qRT-PCR dicha expresión. 7) Para intentar averiguar las razones por las que el ADNr de los cromosomas B está normalmente inactivo, intentaremos disminuir el nivel de expresión de HP1 (Heterochromatin Protein 1), mediante la técnica del ARNi (ARN de interferencia), y analizaremos su incidencia sobre la cantidad de transcritos específicos del ADNr de los cromosomas B, así como sobre la cantidad de ARNm para otras proteínas, y cualesquiera efectos que puedan aparecer a los niveles citogenético y fenotípico. 8) Determinar si los cromosomas B contienen variantes específicas de la región ITS2 del ADNr, y comparar su grado de expresión con otras variantes del genoma. Para ello, realizaremos varios experimentos de secuenciación masiva (mediante pirosecuenciación 454 de Roche) de los amplicones previamente obtenidos mediante PCR con cebadores anclados en las regiones codificadoras adyacentes. Resultados y Conclusiones: 1. Los cromosomas B de Eyprepocnemis plorans son funcionales, al menos en el ADNr que contienen. 2. El cromosoma B1 es el antecesor de todos los cromosomas B de esta especie encontrados en la región mediterránea occidental. 3. Los cromosomas B de E. plorans estaban presentes en todas las partes corporales analizadas, lo que sugiere que son mitóticamente estables. No hemos podido, sin embargo, averiguar si todas estas partes tienen el mismo número de Bs, ya que la herramienta molecular que intentamos diseñar estaba basada en el número de copias de ADNr en los Bs y éste resultó ser muy variable entre Bs de la misma población. 4. Cuando el ADNr del cromosoma B está activo en un individuo, lo está en todas las partes corporales analizadas, pero su grado de expresión en testículo, glándula accesoria y músculo alar es el triple que en cabeza, pata y ciego gástrico. 5. La proteína HP1 es necesaria para mantener el patrón de condensación cromosómica normal de todos los tipos de cromatina en E. plorans, y su función es vital en esta especie. La disminución de los niveles de expresión de HP1, forzada por el ARNi, estaba asociada a la disminución de la expresión del gen Bub1, el descenso del número de células en división, la pérdida de masa muscular y limitación del movimiento, la disminución de la cantidad de hemolinfa y en última instancia, la muerte. 6. El uso de la región codificadora 5.8-28S como control interno de la tasa de error de los experimentos de ¿454 amplicon sequencing¿ es, en el caso del ITS2, una herramienta muy útil para eliminar falsos positivos. 7. El ADNr de E. plorans está muy homogenizado en las regiones codificadoras 5.8S y 28S, pero no tanto en la región ITS2, donde hemos detectado 6 haplotipos en una misma población. Todos los haplotipos mostraban características conservadas en su estructura secundaria, y unos parámetros de energía libre de Gibbs compatibles con su capacidad de expresión. De hecho, todos fueron encontrados en el ADNc. 8. El haplotipo Hap4 resultó ser exclusivo de los cromosomas B, ya que el número de lecturas encontradas en ADNg aumentaba con el número de Bs, y no se encontró en los individuos sin B. 9. Los 6 haplotipos mostraron diferencias en el grado de expresión, siendo Hap5 el más eficiente en su expresión y el Hap4 (el del B) el menos eficiente, ya que se expresaba muy poco incluso en individuos que mostraban que sus Bs eran capaces de organizar un nucleolo. Igualmente, Hap3 y Hap6 eran haplotipos poco eficientes en su expresión, mientras que Hap1 y Hap2 se encontraban entre los más eficientes. 10. El Hap4 es el único cuyas regiones codificadoras estaban conservadas en el 100% de las lecturas en ADNc, a pesar de que, en ADNg, es el haplotipo menos conservado. Esto sugiere que la expresión del ADNr del B está sujeta a una fuerte vigilancia por parte del genoma, es decir, normalmente está muy reprimido, pero cuando se expresa sólo lo hacen sus unidades de ADNr que están más conservadas en la región codificadora. 11. En general, las lecturas de ADNc mostraron menor diversidad nucleotídica para la región ITS2, y estaban más conservadas en las regiones codificadoras 5.8S y 28S, que las del ADNg, por lo que podemos concluir que las unidades de ADNr no se expresan al azar. 12. La total conservación de las regiones codificadoras en las lecturas de ADNc observadas para el Hap4 sugiere que el ARNr transcrito a partir del cromosoma B es totalmente funcional, como lo prueba además que en los 5 machos donde obtuvimos lecturas para este haplotipo en ADNc los Bs fueron observados formando nucleolo, que es el fenotipo de estos genes. Referencias: Cabrero, J., Alché, J.D., Camacho, J.P.M. (1987). Effects of B chromosomes of the grasshopper Eyprepocnemis plorans on nucleolar organiser regions activity. Activation of a latent NOR on a B chromosome fused to an autosome. Genome 29, 116-121. Cabrero, J., López-León, M.D., Gómez, R., Castro, A.J., Martín-Alganza, A., Camacho, J.P.M. (1997). Geographical distribution of B chromosomes in the grasshopper Eyprepocnemis plorans, along a river basin, is mainly shaped by non-selective historical events. Chromosome Res. 5, 194-198. Camacho, J.P.M. (2005). B chromosomes. In: The evolution of the genome (Gregory TR, ed.): 223-286. Henriques-Gil, N., Aranda, P. (1990). Origin and substitution of B chromosomes in the grasshopper Eyprepocnemis plorans. Evolution 44, 747-753. Jones, R.N., Rees, H. (1982). B chromosomes. New York: Academic Press. Jones RN. 1995. Tansley review no. 85: B chromosomes in plants. New Phytol 131: 411¿434. Long, E.O., Dawid, B. (1980). Repeated Genes in Eukaryotes. Annual Review of Biochemistry. 49: 727-764. 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