Desarrollo de biosensores para la detección de hidrocarburos aromáticos en aguas marinas

Resumen

La liberación de compuestos químicos tóxicos producidos por el hombre ejerce sobre la Flora y Fauna un efecto negativo provocando en última instancia el empobrecimiento de la biodiversidad y repercutiendo negativamente en el balance global medioambiental. La liberación al medio ambiente de hidrocarburos aromáticos se produce como consecuencia de actividades industriales, de la utilización masiva de combustibles fósiles y del aumento en el número de incendios forestales provocados por el hombre. Los vertidos de hidrocarburos aromáticos a menudo se encuentran en mezclas complejas y pueden ser fácilmente absorbidos por el tracto gastro-intestinal, donde se transforman en epóxidos con propiedades mutagénicas y carcinogénicas (1) por lo que están incluidos por diversas Agencias de Protección del Medioambiente como compuestos de eliminación prioritaria. Una de las principales fuentes de contaminación del medio marino se debe a vertidos de petróleo producidos durante su transporte, durante la limpieza de las sentinas de los barcos, por derrames accidentales o intencionados de todo tipo de embarcaciones. El proyecto de Tesis Doctoral propuesto se engloba dentro de un proyecto europeo en el que se proponen distintas actuaciones para la identificación y solución de vertidos marinos de petróleo. Una de estas actividades consiste en la construcción de biosensores para la rápida detección de hidrocarburos aromáticos y el trabajo de Tesis propuesto se centra precisamente en este aspecto. Los biosensores celulares (bacterias que han sido genéticamente manipuladas para producir una señal cuantificable en respuesta a la presencia de un compuesto o un grupo de compuestos) son herramientas útiles para el análisis de contaminantes en el medio ambiente. Un biosensor consta de dos elementos: una proteína reguladora y un promotor fusionado a un gen reportero que produce la señal cuantificable. Aunque se han construido numerosos biosensores que detectan una gran variedad de contaminantes, hay muy pocos construidos en bacterias marinas y por tanto que puedan responder a señales que se encuentren en soluciones salinas. En esta Tesis se ha demostrado que se puede llevar a cabo la construcción de biosensores para poder detectar de forma sencilla y eficaz hidrocarburos mono- y poliaromáticos en ambientes marinos. Los principales hitos conseguidos en la misma son: “Caracterización de las bacterias marinas: estudio de la resistencia a antibióticos, de la tasa de crecimiento y de la capacidad de estas bacterias para ser manipuladas genéticamente”. (Capítulo 1) Los experimentos realizados permitieron la selección de aquellas cepas que mostraron tasas de crecimiento adecuadas en medios de laboratorio como en medio marino (que es el entorno donde se iban a realizar los ensayos mayoritariamente), un patrón de resistencia compatible con los vectores genéticos disponibles para la construcción de biosensores y la suficiente versatilidad genética para su posible manipulación genética. Entre las cepas seleccionadas destacar Alcanivorax borkumensis SK2, ya que es una cepa marina. “Sistema bioreportero de hidrocarburos aromáticos monocíclicos tipo benceno, tolueno, etilbenzeno y xyleno (BTEX).” (Capítulo 2) Este biosensor se construyó usando el sistema regulador de la degradación de tolueno, Ptodx-TodST de Pseudomonas putida DOT-T1E, que se introdujo en distintas cepas (P. putida KT2440, P. putida DOT-T1E y Alcanivorax borkumensis SK2). Este biosensor mostró gran especificidad por este tipo de substratos, no siendo activado por PAHs, y gran eficacia y sensibilidad a la hora de detección de BTX (benceno, tolueno y m-, p-xileno) en diferentes entornos (aguas marinas, aguas dulces y tierra). “Sistema bioreportero específico de naftaleno y derivados.” (Capítulo 3) Para construir este sistema bioreportero se usó el sistema regulador del operón phn de Burkholderia sp. Esta construcción se introdujo en la cepa Burkholderia sp. MS3. El biosensor construido detectó naftaleno, 2-metilnaftaleno y con límites de detección 0,2 mM, 0,14 mM y 0,5 % respectivamente. “Sistema bioreportero para la detección de hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs).” (Capítulo 4) En primer lugar, se caracterizó la cepa Novosphingobium sp. HR1a, capaz de degradar un amplio espectro de PAHs, se identificaron los genes involucrados en esta capacidad biodegradadora y en su regulación. Se utilizó el promotor de la dioxigenasa PhaA (primera enzima involucrada en la degradación de PAHs) de Novosphingobium sp. HR1a. El biosensor construido detectó fenantreno, naftaleno, 2-metilnaftaleno con un límite de detección 8 μM, 37 μM, y 0,09 mM respectivamente. En conjunto, los biosensores construídos fueron específicos para los contaminantes seleccionados. Todos ellos fueron probados en muestras contaminadas, bien con gasolina o gasoil, o en muestras ambientales con historial de contaminación. En todos los casos los biosensores respondieron a los contaminantes cuando éstos estaban presentes en las muestras y no dieron falsos positivos. Los niveles de detección de contaminantes en muestras ambientales fue más bajo que los determinados para compuestos puros, probablemente porque en las muestras complejas hay otros inductores, porque otros compuestos de las mezclas aumenten la biodisponibilidad de los contaminantes o por procesos de disolución y degradación que puedan estar favorecidos por los biosensores utilizados. Referencia: 1) Sato H. and Y. Aoki (2002). Curr. Drug Metab. 3:311-319