Bibliotecas combinatoriales enfocadas en ingeniería de proteínasaplicaciones en termoestabilización, promiscuidad y diseño de sitios activos

Resumen

En la presente Tesis hemos abordado estudios relacionados con objetivos clave en la ingeniería de proteínas, como son el diseño de sitios activos, el aumento de la termoestabilidad y el aumento de actividades promiscuas. Dichos estudios fueron llevados a cabo en base al análisis de pequeñas bibliotecas combinatoriales de variantes proteicas, cuyas mutaciones fueron propuestas por distintos criterios en cada caso, bien estructurales, evolutivos o computacionales, con el fin de focalizar la búsqueda de mutaciones beneficiosas. Hay dos aspectos novedosos en la metodología utilizada que conviene resaltar. En primer lugar, la aplicación de una técnica de regresión multivariante, la llamada regresión por mínimos cuadrados parciales, comúnmente utilizada en las ciencias sociales, que nos puede permitir, con el estudio de unas pocas variantes, modelar la relación entre genotipo y fenotipo, y de esta forma inferir el comportamiento de toda la biblioteca, y por ende acceder a las mejores variantes, incluso en casos en los que el cribado de alto rendimiento no sea posible. En segundo lugar, y relacionado con objetivos de optimización simultanea de varias características, hemos utilizado un enfoque basado en la predicción de la frontera de Pareto, un concepto utilizado comúnmente en economía y que se ha empezado a utilizar muy recientemente en ingeniería de proteínas. La eficacia de estas metodologías ha sido testada en esta Tesis con bibliotecas combinatoriales pequeñas, aunque creemos que pueden convertirse por sus características en herramientas provechosas para el estudio de grandes bibliotecas de mutantes. Respecto a los objetivos específicos abordados, cabe reseñar en primer lugar que hemos demostrado la posibilidad de combinar procedimientos de estabilización electrostáticos y evolutivos para conseguir proteínas de muy alta estabilidad. Este resultado es de gran importancia general dado que la estabilidad es una limitación en muchos estudios de ingeniería de proteínas, en particular aquellos enfocados al diseño de funciones de novo. En segundo lugar, hemos demostrado que proteínas estabilizadas pueden ser suficientemente robustas como para soportar muchas mutaciones disruptivas de tipo residuo hidrofóbico a residuo ionizable, incluso cuando se introducen en la misma región de la estructura. Este resultado puede ser relevante para la ingeniería de sitios activos y puede tener implicaciones para la compresión de la evolución de las primeras enzimas. Finalmente, nos hemos planteado desarrollar una metodología evolutiva general para el estudio de la modulación simultánea de las actividades promiscua y nativa en proteínas. La aplicación de esta metodología al origen de la catálisis del plegamiento en dominios de tiorredoxina revela un escenario inesperado: diversos patrones de modulación de las actividades primaria y promiscua son posibles incluyendo el aumento simultáneo en ambas. Hemos demostrado además que este escenario puede explicarse fácilmente en términos de la llamada hipótesis de la diversidad conformacional. En conjunto estos resultados pueden contribuir a clarificar los mecanismos de evolución de nuevas funciones. Desde otro punto de vista, la reconstrucción por mínimos cuadrados parciales, combinada con la predicción de la frontera de Pareto que hemos usado, puede constituir la base computacional de un protocolo de evolución dirigida enfocado a la mejora simultánea de varias propiedades de una proteína y creemos, por tanto, que puede abrir nuevas posibilidades en la ingeniería de proteínas multifuncionales.