Isolation and characterization of a pseudomonas putida with potential use as biofertilizer and its environmental applications

Résumé

En los últimos años se ha producido un endurecimiento en la legislación para el uso de fertilizantes químicos inorgánicos, derivado de sus efectos adversos sobre el medio ambiente y a que este tipo de productos no tienen en cuenta otras posibles deficiencias de nutrientes en el suelo, como en el caso del fósforo y el hierro, debido a que los fertilizantes al uso no se componen de formas fácilmente biodisponibles de estos elementos para las plantas. En consecuencia, se ha iniciado la búsqueda y estudio de nuevas fuentes naturales de abonos, bioestimulantes y enmiendas para el suelo, unido a la creciente importancia que ha tomado la agricultura ecológica. El conocimiento de las interacciones que se producen en la rizosfera entre plantas y microorganismos, es esencial para el desarrollo de nuevas herramientas biotecnológicas, basadas en microorganismos promotores del crecimiento vegetal (PGPR, Plant Growth-Promoting Rhizobacteria), que pueden aumentar el rendimiento de las cosechas, además de la disminución en el uso de agroquímicos y promover la restauración de ecosistemas afectados por perturbaciones, ya sean de origen natural y/o debidas a actividades antrópicas. El desarrollo de productos de origen biológico comprende el uso de microorganismos vivos que colonizan eficazmente la rizosfera, son capaces de mantenerse en ella y, además, de producir nutrientes asimilables por la planta hospedadora, influenciar positivamente de manera indirecta el crecimiento y desarrollo de la raíz y/o estimular el crecimiento de la planta mediante el control de patógenos. Con dichos antecedentes, esta tesis se centró en la caracterización de una microorganismo rizosférico, Pseudomonas putida BIRD-1, que se aisló de suelo rizosférico y que tiene la capacidad de solubilizar nutrientes de baja disponibilidad y de producir fitohormonas que promueven el crecimiento vegetal. Como objetivo general esta tesis se propone superar las limitaciones en el conocimiento del efecto que ejercen distintas condiciones ambientales sobre los inoculantes microbianos, y mejorar la tecnología de aplicación de los mismos en condiciones que son adversas para el correcto desarrollo de especies vegetales de interés. En el capítulo 1 se ha realizado una caracterización de Pseudomonas putida BIRD-1, que es un rizobacteria promotora del crecimiento vegetal (PGPR) cuyo genoma tiene un tamaño de 5,7 Mpb. Esta cepa se adhiere eficientemente a las raíces de las plantas y coloniza la rizosfera alcanzando altas densidades celulares, incluso en suelos con sólo el 2% de humedad. Esta propiedad parece estar ligada a su capacidad de sintetizar trehalosa, como se deduce del hecho de que un mutante deficiente en la síntesis de trehalosa es menos tolerante a la desecación que la cepa parental. El genoma de BIRD-1 codifica también una amplia gama de proteínas que ayudan a lidiar con el estrés provocado por especies reactivas de oxígeno generada en la rizosfera de las plantas. Las propiedades PGPR de Pseudomonas putida BIRD-1 se derivan de su capacidad para solubilizar fósforo y hierro, y producir fitohormonas. BIRD-1 es capaz de solubilizar formas insolubles de fosfato inorgánico a través de la producción de ácido. Además, el genoma de BIRD-1 codifica al menos 5 fosfatasas relacionadas con la solubilización de fósforo; una de ellas es una fitasa que facilita la utilización de ácido fítico, la principal forma de almacenamiento de fósforo orgánico en las plantas. La pioverdina es el principal sideróforo producido por esta cepa; un mutante en la sideróforo sintasa FvpD no crecía en medio líquido sin suplemento de hierro, sin embargo, en suelo el mutante FvpD era tan competitivo como la cepa parental, ya que posee un gran número de receptores que captan los sideróforos producidos por otros microbios, lo que permite la adquisición de hierro y su supervivencia en el suelo. BIRD-1 produce en exceso ácido indol-3-acético a través dos de vías convergentes, lo que influye en su capacidad para estimular la germinación de semillas y crecimiento de las plantas. En el capítulo 2 se planteó el uso de Pseudomonas putida BIRD-1, en consorcio con otras bacterias, en un ensayo de biorremediación y rizorremediación a escala de campo, para recuperar una zona incendiada, que se enmarca dentro de un espacio natural protegido. Los incendios forestales constituyen una grave amenaza para los países de la cuenca mediterránea, que pueden arrasar grandes extensiones de bosques cada año. Después de los incendios, los suelos son más propensos a sufrir erosión y se inhibe su capacidad de recuperación, en parte, por los compuestos tóxicos producidos durante la combustión de la celulosa y la lignina. En este estudio se analizó el uso de técnicas de biorremediación y rhizoremediation para la restauración del suelo en un estudio de campo a gran escala en un ecosistema mediterráneo protegido después de un incendio controlado. En la estrategias de biorremediación y rizorremediación planteadas, se combina el uso de cepas de Pseudomonas putida, microorganismos cultivables indígenas y gramíneas anuales. Después de ocho meses de seguimiento de los parámetros de calidad del suelo, incluida la eliminación de hidrocarburos monoaromáticos e hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAPs), así como la evolución de la cubierta vegetal, se encontró que los niveles de los parámetros analizados eran equiparables a los previos al incendio. El análisis de la población microbiana reveló que los incendios indujeron cambios en la microbiota indígena, y que la estrategia de rizorremediación favorece la recuperación de la microbiota del suelo. La combinación de microorganismos y plantas analizada en este estudio representa una estrategia eficaz para la restauración de los suelos después de un incendio forestal. En el capítulo 3 se planteó el uso de Pseudomonas putida BIRD-1, en consorcio con otras bacterias, en un ensayo de biorremediación y rizorremediación a escala de campo, para recuperar una contaminada por hidrocarburos de petróleo. Los lodos de depuradora procedentes del refinado del petróleo son tóxicos y peligrosos, por lo tanto, las agencias de protección del medio ambiente han declarado prioritario el tratamiento para la inactivación de los residuos de petróleo debido a su toxicidad y peligrosidad. Los tratamientos físico-químicos son costosos y perjudiciales para el medioambiente, y los tratamientos biológicos alternativos son menos costosos, pero, en general, funcionan a un ritmo más lento. Se realizaron tratamientos de biorremediación y rizorremediación en una zona contaminada con lodos de refinería de petróleo en condiciones de clima semiárido. Los tratamientos de biorremediación y rizorremediación incluyeron el uso de un consorcio microbiano formado por rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPRs) y bacterias degradadoras de hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAPs), y el uso combinado del consorcio mencionado junto con especies vegetales pratenses, respectivamente. El tratamiento de rizorremediacioón reveló que el desarrollo de la vegetación favorecía el incremento de las poblaciones microbianas con potencial para eliminar los desechos derivados del petróleo, lo que se tradujo en la disminución de los hidrocarburos totales de petróleo (HTPs), siete meses después del establecimiento de dichos tratamientos biológicos. Finalmente, se planteó establecer qué genes, de aquellos que están descritos como esenciales para la proliferación y adaptación de Pseudomonas putida en la rizosfera, se encuentran conservados específicamente en Pseudomonas putida BIRD-1 y, en general, en el resto de cepas de P. putida cuyos genomas actualmente se encuentran secuenciados. Una búsqueda bibliográfica reveló que se han descrito 180 genes involucrados en la aptitud de P. putida para sobrevivir en la rizosfera, cuyos productos génicos están relacionados con diversas capacidades como la adhesión a superficies bióticas y la capacidad de formar biofilms, síntesis de flagelo, quimiotaxis, reguladores y sensores, adaptación a estreses, reparación del ADN, mecanismos de transporte y secreción y metabolismo de diversos compuestos presentes en la rizosfera. Un estudio in silico, reveló que estos genes se encuentran conservados, en general, en las cepas de P. putida secuenciadas y, en particular, en Pseudomonas putida BIRD-1 confirmando esta cepa tiene la maquinaria genética para sobrevivir y proliferar en la rizosfera. Además, se perfila como una excelente candidata para su uso en agricultura y como parte de tratamientos destinados a la remediación de ecosistemas incendiados y suelos contaminados con hidrocarburos de petróleo.